Условия использования Контакты О проекте
EN RU
  1. Главная
  2. О проекте

GFAP

 Основные результаты работы изложены:

А.С. Харламова, Е.Г. Отлыга, О.С. Годовалова, О.А. Юнеман и С.В. Савельев 2023. Профили астроцитарной дифференцировки переднего мозга человека на внутриутробном этапе онтогенеза.

Kharlamova A, Krivova Y, Proshchina A, Godovalova O, Otlyga D, Andreeva E, Shachina M, Grushetskaya E, Saveliev S. Spatial-temporal representation of the astroglial markers in the developing human cortex.

9-10

11-12

12-13

13-14

14-15

15-16

16-17

19-20

21-22

23-24

26-27

29-30

 

 

 

 

+

+

+

+

+

+

+

+

 

Одним из наиболее распространенных маркеров  астроцитов как в  модельных исследованиях, так и  в  работах на аутопсийном и биопсийном материале человека, включая плодный, являются антитела к глиальному кислому фибриллярному белку (GFAP) – маркеру зрелой астроцитарной глии. В мозге взрослых млекопитающих антитела к GFAP выявляют в основном астроцитах белого вещества. В развивающемся мозге млекопитающих экспрессия GFAP также отмечается для клеток радиальной глии, однако способность антител выявлять белок зависит от конкретного производителя.


Глиальный фибриллярный кислый белок (glial fibrillary acidic protein или GFAP) относится к глиальным маркёрам, является белком III типа промежуточных филаментов (ПФ) и образует глиальные ПФ зрелых и дифференцирующихся астроцитов [1]. Название белка обусловлено его локализацией в глиофибриллах и высоким содержанием дикарбоновых аминокислот в его составе. GFAP впервые выделили из фиброзных астроцитов головного мозга пациентов с рассеянным склерозом в 1969 г.

GFAP состоит из 432 аминокислот и имеет молекулярную массу около 50 кДа [2]. Ген GFAP расколожен на 17й хромосоме и включает 9 экзонов. Его структура идентична у мыши, крысы и человека [3]. Путём альтернативного сплайсинга мРНК GFAP образуются 6 изоформ этого белка: α, β, γ, δ, ε и κ [4]. Ген GFAP экспрессируется во многих типах клеток ЦНС, включая астроциты и эпендимальные клетки в процессе развития [5, 6]. Также GFAP был обнаружен в клубочках и перитубулярных фибробластах почек крысы [7], в клетках Лейдига яичек у хомяков и людей [8], в человеческих кератиноцитах [9], остеоцитах и хондроцитах [10], а также в звёздчатых клетках поджелудочной железы и печени у крыс [11].

GFAP способен образовывать как гомо-, так и гетерополимеры с виментином – белком ПФ III класса и нестином VI класса [12].

Функции GFAP до сих пор окончательно не изучены, несмотря на многочисленность исследований, в которых он используется в качестве маркёра. Известно, что GFAP в составе ПФ играет важную роль в модуляции движения астроцитов, обеспечении стабильной морфологии их тел и отростков [1]. Считается, что GFAP необходим для формирования нормальной архитектоники белого вещества, поддержания целостности гемато-энцефалического барьера, а также для образования глиального рубца на месте повреждённого участка мозга [13]. Есть данные о том, что GFAP участвует в регуляции объёма астроцитов, играет важную роль в нейроно-глиальных взаимодействиях и в прикреплении глутаматных транспортёров к плазматической мембране при реутилизации нейротрансмиттеров, а также, предположительно – в механизмах формирования памяти [1].

Существуют межвидовые отличия в экспрессии GFAP: у приматов она начинается уже в эмбриогенезе, в самый активный период нейромиграции, а у грызунов – только в постнатальный период. Увеличение экспрессии GFAP наблюдается практически при всех патологиях ЦНС, таких как ишемия, травматическое повреждение мозга, воспаление, ряд нейродегенеративных и онкологических заболевений. При этом наблюдается пролиферация и гипертрофия астроцитов (реактивный астроглиоз). Считается, что такой ответ астроцитов на действие патологических факторов неспецифичен и зависит от дозы и продолжительности их действия, а не от их природы. Увеличение экспрессии GFAP также происходит с возрастом (возрастной глиоз), при этом увеличивается количество и размер астроцитов.

Мутации в гене GFAP приводят к возникновению болезни Александера (она же – лейкодистрофия розенталя) [1]. Это тяжёлое наследственное заболевание ЦНС с высокой летальностью, впервые было описано В.С. Александером в 1949 г. у 15-месячного ребёнка с мегалэнцефалией, гидроцефалией, лейкодистрофией и психомоторными нарушениями. Патогномоничным признаком заболевения является скопление в цитоплазме астроцитов эозинофильных включений (волокон Розенталя). Они состоят из GFAP, виментина, убиквитина, белков теплового шока, плектина и белка p62 [14]. При болезни Александера такие астроциты встречаются во всех отделах головного мозга, преимущественно в субпиальной, перивентрикулярных и периваскулярных зонах. Наличие в составе глиальных ПФ аберрантного GFAP приводит к нарушению их полимеризации и сборки [15]. В результате нарушаются важнейшие функции автроцитов: снижается транспорт веществ через ГЭБ вследствие уменьшения количества пиноцитозных пузырьков, снижается антиоксидантная активностость астроцитов, приводя к повреждению свободными радикалами липидного компонента миелина, а также нарушается нейроно-астроцитарное взаимодействие, что ведёт к снижению метаболической функции астроцитов и снижению контроля за синаптической активностью [16].

 

Пропись иммуногистохимического окрашивания головного мозга

эмбрионов и плодов человека для антител к GFAP:

 

Для выявления GFAP (glial fibrillary acidic protein) – глиального фибриллярного кислого белка использовали мышиные моноклональные антитела: Mouse Monoclonal Antibody, Neomarkers (LabVision, ThermoSci) ; Prod # MS-280-P1, Lot #280P808A.

 

Термическое демаскирование антигенов не проводилось.

 

Визуализацию результатов иммуногистохимического окрашивания осуществляли с помощью UltraVision Quanto Detection System (HRP Polymer) или Ultra Vision LP Detection System, HRP Polymer (RTU) с диаминобензидином в качестве хромогена (Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA, USA). В каждом случае растворы, входящие в набор визуализирующей системы использовались в соответствии с рекомендациями производителя.

Подготовка материала:

 

Мы работаем с коллекционным материалом, где образцы для длительного хранения содержатся в забуференном параформальдегиде (pH 7,2-7,4). Фиксация в спиртах может приводить к сильному сжатию образцов головного мозга от плодов человека. Кроме формалиновой фиксации в коллекции применялась фиксация по методу Буэна, однако от нее отказались в силу специфики влияния на некоторые антигены и последующее выявление с помощью иммуногистохимии.

Обезвоживание осуществлялось через смесь изопрепа с дистилированной водой повышающейся концентрации: от 50% до 100% изопрепа. Заливка в гистомикс с добавлением 5-10% воска.

 

Иммуногистохимическое окрашивание осуществлялось согласно следующей прописи:

 

  1. Депарафинирование срезов и доведение их до воды. Осуществляется погружением стёкол последовательно в 3 порции ксилола, 3 порции 96° спирта, и 1 порцию 70° спирта - на 3 мин в каждую. При низкой температуре в помещении (менее 22°С) или большой толщине срезов (более 10 мкм) пребывание стёкол в каждой порции ксилола рекомендуется увеличить до 4-5 мин. Затем перенести стёкла в дистиллированную воду на 1-2 мин.

  2. Инактивация эндогенной пероксидазы: 3% раствор H2O2 – 20 мин.

  3. Ополаскивание стёкол в дистиллированной воде.

  4. Ополаскивание стёкол в PBS (pH 7.2-7.6).

  5. Разграничение срезов на стёклах: промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов для образования сухой поверхности, после чего обвести каждый срез специальным гидрофобным фломастером (Daco Pen, Liquid Blocker, PAP Pen и др. Также можно использовать тонкую свечку или заточенный наподобие карандаша брусок парафина).

  6. UltraVision Protein Block. Покрыть каждый срез блокировочным раствором и оставить при комнатной температуре на 5 мин (в соответствии с протоколом производителя). Здесь и далее объём реактива, наносимого на срезы, определяется эмпирически в соответствии с размером срезов.

  7. Погружение стёкол в PBS (pH 7.2-7.6). После погружения аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.

  8. Инкубация с первыми антителами: нанести на срезы необходимое количество первичных моноклональных мышиных антител к GFAP (Thermo Fisher Scientific, разведения 1:100 – 1:200; Cat. # MS- 280-P1). Инкубировать в течение ночи (Overnight) при +4°С во влажной камере. Может быть заменена на 2-3-часовую инкубацию во влажной камере при +36°С, однако по нашему опыту Overnight-инкубация при +4°С даёт лучшие результаты.

  9. Отмывка первых антител: 4 смены PBS (pH 7.2-7.6). В первой смене ополоснуть, во 2-4 сменах - по 10 мин. После отмывки – аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.

  10. Усилитель первых антител (Primary Antibody Amplifier Quanto или Primary Antibody Enchancer LP) – 10 мин.

  11. Отмывка усилителя первых антител: 4 смены PBS (pH 7.2-7.6). В первой смене ополоснуть, во 2-4 сменах - по 10 мин. После отмывки – аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.

  12. HRP Polymer Quanto или Large Volume HRP Polymer (LP) – 15 мин. в тёмных камерах.

  13. Отмывка HRP Polymer: 4 смены PBS (pH 7.2-7.6). В первой смене ополоснуть, во 2-4 сменах - по 10 мин. После отмывки – аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.

  14. Диаминобензидин (DAB) свежеприготовленный в соответствии с рекомендациями производителя из набора Ultravision Plus Detection System: Large Volume DAB Plus Substrate System (RTU) (Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA, USA) – 8 мин. При необходимости, срезы можно подкрасить гематоксилином [1], но мы такое подкрашивание не проводили.

  15. Ополаскивание в PBS (pH 7.2-7.6).

  16. Ополаскивание в дистиллированной воде.

  17. Обезвоживание (по 5 мин. в каждом растворе):

  1. Заключение в канадский бальзам или его аналоги (Shandon Synthetic Mountant, полистирол, пермаунт, DPX или другие подобные среды).

Результат: в результате проведения реакции цитоплазма тел и отростков астроцитов окрашивается в коричневый цвет. Если использовалось подкрашивание гематоксилином, ядра клеток будут окрашены в различные оттенки синего цвета.

Для подробного описания иммуногистохимической реакции на GFAP см. [1, 17].

Литература:

  1. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии: руководство / под ред. Д.Э. Коржевского. 2-е издание, исправленное и дополненное. – СПб.: СпецЛит, 2014. – 119 с.

  2. Bongcam-Rudloff E. et al. Human glial fibrillary acidic protein: complementary DNA cloning, chromosome localization, and messenger RNA expression in human glioma cell lines of various phenotypes //Cancer research. – 1991. – Т. 51. – №. 5. – С. 1553-1560.

  3. Condorelli D. F. et al. Tissue-specific DNA methylation patterns of the rat glial fibrillary acidic protein gene //Journal of neuroscience research. – 1994. – Т. 39. – №. 6. – С. 694-707.

  4. Blechingberg J. et al. Regulatory mechanisms for 3′-end alternative splicing and polyadenylation of the Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP, transcript //Nucleic acids research. – 2007. – Т. 35. – №. 22. – С. 7636-7650.

  5. Jacque CM, Vinner C, Kujas M, Raoul M, Racadot J, Baumann NA (January 1978). "Determination of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in human brain tumors". Journal of the Neurological Sciences. 35 (1): 147–155. doi:10.1016/0022-510x(78)90107-7

  6. Roessmann U, Velasco ME, Sindely SD, Gambetti P (October 1980). "Glial fibrillary acidic protein (GFAP) in ependymal cells during development. An immunocytochemical study". Brain Research. 200 (1): 13–21. doi:10.1016/0006-8993(80)91090-2

  7. Buniatian G, Traub P, Albinus M, Beckers G, Buchmann A, Gebhardt R, Osswald H (January 1998). "The immunoreactivity of glial fibrillary acidic protein in mesangial cells and podocytes of the glomeruli of rat kidney in vivo and in culture". Biology of the Cell. 90 (1): 53–61. doi:10.1016/s0248-4900(98)80232-3

  8. Maunoury R, Portier MM, Léonard N, McCormick D (December 1991). "Glial fibrillary acidic protein immunoreactivity in adrenocortical and Leydig cells of the Syrian golden hamster (Mesocricetus auratus)". Journal of Neuroimmunology. 35 (1–3): 119–129. doi:10.1016/0165-5728(91)90167-6

  9. von Koskull H (1984). "Rapid identification of glial cells in human amniotic fluid with indirect immunofluorescence". Acta Cytologica. 28 (4): 393–400.

  10. Kasantikul V, Shuangshoti S (May 1989). "Positivity to glial fibrillary acidic protein in bone, cartilage, and chordoma". Journal of Surgical Oncology. 41 (1): 22–26. doi:10.1002/jso.2930410109

  11.  Apte MV, Haber PS, Applegate TL, Norton ID, McCaughan GW, Korsten MA, et al. (July 1998). "Periacinar stellate shaped cells in rat pancreas: identification, isolation, and culture". Gut. 43 (1): 128–133. doi:10.1136/gut.43.1.128

  12. Eliasson C. et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes //Journal of Biological Chemistry. – 1999. – Т. 274. – №. 34. – С. 23996-24006.

  13. Pekny M. et al. Abnormal reaction to central nervous system injury in mice lacking glial fibrillary acidic protein and vimentin //The Journal of cell biology. – 1999. – Т. 145. – №. 3. – С. 503-514.

  14. Cho W., Messing A. Properties of astrocytes cultured from GFAP over-expressing and GFAP mutant mice //Experimental cell research. – 2009. – Т. 315. – №. 7. – С. 1260-1272.

  15. Li R. et al. GFAP mutations in Alexander disease //International journal of developmental neuroscience. – 2002. – Т. 20. – №. 3-5. – С. 259-268.

  16. Mignot C. et al. Alexander disease: putative mechanisms of an astrocytic encephalopathy //Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. – 2004. – Т. 61. – №. 3. – С. 369-385.

  17. Сухорукова Е.Г., Коржевский Д.Э., Кирик О.В. и др. Иммуногистохимическое выявление астроцитов головного мозга при черепно-мозговой травме. Судебно-медицинская экспертиза. 2010. №1. С.14-16.