Создание систематизированных тематических баз данных является эффективным решением для оцифровывания, упорядочивания и объединения существующих и постоянно пополняющихся данных в разных областях биологии и медицины.
Целью проекта АТЛАС РАЗВИТИЯ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА (АРМЧ) является создание иммунофенотипической карты нейрогенеза во время нормального внутриутробного развития в отдельных областях коры головного мозга человека с учетом внутри- и межрегиональной специфики созревания и гетерохроний развития.
Материал
Основным материалом для проекта служит обновляемая #Коллекция пренатального развития человека лаборатории развития нервной системы НИИ Морфологии человека, которая охватывает период со 2-й недели внутриутробного развития до рождения. Работа с материалом ведется в рамках международных соглашений и одобрена локальным этическим комитетом ФГБНУ НИИ морфологии человека.
Эмбриональный и плодный материал по раннему развитию человека - очень индивидуально изменчив. Периодизация развития эмбрионов носит весьма условный характер, так как в реальном онтогенезе не существует никаких "стадий". Тем не менее для удобства определения возраста и описания эмбрионов и плодов мы используем классификацию, предложенную в 2006 г. Миловановым и Савельевым.
В этой классификации выделяются:
- Зародышевый период от 1до 21 дня после оплодотворения, включающий 1-8 стадии развития по Карнеги
- Эмбриональный период с 22 по 56-57 день после оплодотворения, 9-23 стадии по Карнеги.
- Предплодный период (9-10 недели после оплодотворения (по), 11-12 - акушерский (гестационный) возраст (гв), постменструальный срок).
- Плодный период с 13 недель гв до рождения ребенка.
В свою очередь плодный период можно подразделить на три отрезка:
- Раннефетальный период - 13-20 нед. гв
- Среднефетальный период - 21-28 нед. гв
- Позднефетальный период - 29-40 нед. гв
Гистологические методы.
Большая часть коллекции хранится в забуференном формалине. Для гистологического исследования изготавливаются серийные срезы полушария, или мозга, или головы плода целиком в зависимости от стадии развития плода. Полученные срезы окрашиваются в соответствии с применяемой методикой гематоксилином и эозином, по Маллори или по Нисслю.
Иммуногистохимические методы (ИГХ)
В наших исследованиях мы традиционно применяем сравнительный иммуноморфологический подход: на разных стадиях развития изготавливаются кассированные серии срезов аутопсийного материала интересующего органа. На последовательных сериях срезов проводится референсное гистологическое окрашивание и ставятся реакции с антителами к различным популяциям клеток, что позволяет сопоставлять иммунофенотипы на соседних срезах и отслеживать пространственно-временную динамику в зонах интереса по мере роста и развития органа, используя морфометрические исследования с их последующей статистической обработкой. Мы применяем этот же подход на целых срезах головного мозга человека во время пренатального развития. Преимуществом иммуноморфологичсекого подхода является совмещение классического цитоархитектонического анализа с современными иммуногистохимическими техниками, что позволит провести анализ иммунофенотипа конкретных участков коры развивающегося мозга и осуществить регионспецифичное типирование клеток различных линий дифференцировки на разных этапах пренатального онтогенеза с последующим сравнением разных регионов. Немаловажно, что, благодаря современным методам иммуногистохимии и иммунофлуоресценции, на одном срезе можно отслеживать сразу несколько маркеров.
Выбор линейки маркеров для реализации проекта иммуноморфологического анализа обусловлен как собственным опытом и данными о стабильности работы антител на материале плодов человека, так и опубликованными данными оригинальных исследований и общедоступной информацией в рамках тематических международных проектов. Предпочтение в каждой очереди опытов отдается маркерам, наиболее хорошо зарекомендовавшим себя в мировой научно-исследовательской и медицинской практике и стабильно работающим на материале плодов человека. Таким образом, результаты будут сопоставимы для сравнения с результатами других научных групп, полученными на материале эмбрионов и плодов человека.
Оцифровка срезов мозга
Для базовых аннотированных атласов создаются библиотеки изображений виртуальных срезов с детализацией, доступной для объективов светового микроскопа (до сорокакратного увеличения). Оцифровка препаратов проводится с помощью системы создания виртуальных слайдов гистологических препаратов на установке МЕКОС-Ц2. Система собирает сотни отдельных полей зрения в продольные полосы, которые позже сшиваются вместе, чтобы создать одно большое изображение. Время экспозиции, баланс белого и коррекция плоского поля устанавливаются независимо для каждого среза. Постобработка, полученных изображений, включает в себя перевод из внутреннего формата системы в файлы формата svs, а затем для выбранных срезов переводится в формат Jpg, для создание основы для референсного атласа и для предоставления на сайте проекта. Параллельно проводится финальная корректировка полученных изображений.
Разметка и аннотирование структур головного мозга плодов
Отдельной задачей является картирование и аннотирование виртуальных препаратов . Цифровые изображения гистологических срезов размечаются и подписываются в программе Adobe illustrator. Каждая векторная область связана с определенной структурой мозга и аннотирована; сопоставляющий вектор таким образом позволяет гибко создавать различные режимы представления (например, осуществлять заливку).Полученная векторная графика преобразовывается в масштабируемую векторную графику (SVG).
Аннотирование производится в соответствии с принятой в 2019 г. международной эмбриологической терминологией (TE2) и публикациями по развитию определенных структур со специальными ссылками на принципы эволюционной номенклатуры. Различия между существующими неврологическими традициями сопоставляются с классическими немецкими, американскими и российскими (Советский Союз) онтологическими принципами и с недавним "стандартом" анатомической онтологии, представленным в Nieuwenhuys et al. (2008), Terminologia Neuroanatomica (Ten Donkelaar et al., 2017) и Атласе мозга Аллена в качестве онлайн-источника (https://atlas.brain-map.org /). Структуры картируются и аннотируются в соответствии со сравнительными эволюционными и онтогенетическими критериями – от общего к частному, от сложных структур к частям и подразделениям в соответствии с ходом развития. Предварительная разметка производится в соответствии с Атласом мозга Аллена в качестве онлайн-источника (https://atlas.brain-map.org /)
Литература:
- Внутриутробное развитие человека/ Руководство для врачей / Под редакцией А.П. Милованова, С.В. Савельева. — М.: МВД, 2006. — 384 с.