1. Главная
2. О проекте

окраска по Маллори

 

9-10	11-12	12-13	13-14	14-15	15-16	16-17	19-20	21-22	23-24	26-27	29-30
+		+	+	+		+

Трёхцветное окрашивание соединительной ткани по Маллори (ОМ).

Метод впервые был предложен американским гистологом Ф.Б. Маллори в 1900 году [1]. Однако уже в 1948 Ромейс, в своей классической книге, которая десятилетиями считалась «библией» для гистологов и до сих пор во многом сохраняет свою актуальность, пишет, что ОМ «в настоящее время применяется редко, поскольку он превзойдён рядом модификаций» [2]. В более современных источниках читатель уже не обнаружит столь категоричных суждений, но может столкнуться с противоречивостью мнений, согласно которым одни уважаемые авторы широко используют ОМ и рекомендуют его к применению, причём не только для окрашивания соединительной ткани [3, 4], а другие даже не приводят описания оригинального ОМ в своих руководствах [5], отдавая предпочтение его более поздним модификациям. Мы в этом кратком обзоре обсудим особенности, преимущества и недостатки ОМ, чтобы читатель смог составить своё мнение о методе, и решить, стоит ли его использовать, как это постоянно делаем мы в нашей лаборатории.

Прежде всего, следует пояснить, что у нас речь пойдёт об оригинальной прописи Маллори [2], в которой ядра окрашиваются кислотным фуксином, а не гематоксилином или борным кармином, как в некоторых модификациях метода. Метод называют трёхцветным, или трихромным, поскольку предполагает использование трёх разных красителей: сначала – кислотного фуксина в водном растворе, а затем анилинового синего и оранжевого Ж (Orange G) в составе красящей смеси.

Кислотный или кислый фуксин - получают путем замещения водорода в ядре розанилина (розанилин - основной анилиновый краситель трифенилнафтилметановой группы) группой SO₃Na; обычно он содержит примесь сернокислого парарозанилина. Назван фуксином из-за сходства цвета с окраской цветов фуксии. Водный раствор кислого фуксина (0,5—1%) используют для фоновой окраски; он придает цитоплазме розовый, а коллагеновым волокнам - ярко-красный цвет. Кислый фуксин входит в состав красящих смесей для гистологического исследования соединительной ткани (методы Ван-Гизона, Маллори, Эрлиха —Бионди окраска) и нервной ткани (методы окраски Альцгеймера), выявления митохондрий (методы Альтманна ) и др. [6]. Используется как в гистологии, так и в микробиологии для окрашивания бактерий. Другие примеры использования кислого фуксина при исследовании тканей человека и животных включают судебную гистопатологическую процедуру окрашивания следов сжатия на коже и различные способы селективной идентификации нейронов, поврежденных в результате болезни. Ботаники используют кислый фуксин для флуоресцентного окрашивания белков в гранулах крахмала и обнаружение яиц мух в листьях [7].

Анилиновый синий – это традиционное название, применяемое к анионным красителям, полученным в результате последовательного фенилирования и сульфирования основного фуксина. Таким образом, все красители, продаваемые как «анилиновый синий», являются смесями. Раньше считалось, что это смеси из метилового синего и водного синего [8]. Однако аналитическая работа, использующая более современные методы показала, что «анилиновый синий», «метиловый синий» и «водный синий» обычно представляют собой смеси из одного и того же набора компонентов [7]. Анилиновый синий, как таковой или номинально как метиловый синий или водный синий, является составной частью широко используемых полихромных красителей (азановая окраска по Гейденгайну, трихромный метод Маллори, окрашивание по Манну, Массону и Лендруму) [5, 7]. Менее общеупотребительные методы использования анилинового синего включают в себя окрашивание эндокутикулы насекомых или грибов внутри растительных клеток. Окрашивание гистонов с его помощью стало стандартной процедурой для определения зрелости клеточного ядра. Также анилиновый синий используется для оценки жизнеспособности спермы, и для селективного окрашивания каллозы в растительных образцах [7].

Оранжевый Ж (Orange G) - органическое соединение с химической формулой C₁₆H₁₀N₂Na₂O₇S₂, относящееся к азокрасителям. Он является компонентом многих биологических красителей, обычно в качестве фонового или цитоплазматического красителя. Наиболее распространённое применение – в клинической цитологии в некоторых вариантах окрашивания мазка по Папаниколау (эффективный метод, с помощью которого выявляют предраковые и раковые клетки во влагалище и шейке матки). В гистопатологии Оранжевый Ж является компонентом ОМ и многих его модификаций, таких, как азановое окрашивание по Гейденгайну. Также он используется как компонент окрашивания для идентификации белковых телец в эндосперме риса, при исследовании кормовых белков и в качестве индикатора при отслеживании легочного кровотока у кроликов [7].

= = = = = = = = = = = = =

В результате применения перечисленных красителей при ОМ коллагеновые и ретикулиновые волокна окрашиваются в темно-синий цвет, амилоид, слизь, гиалин — в синий, ядра клеток — в оранжево-красный, ганглиозные нервные клетки, осевые цилиндры нервных волокон и нейроглия — в фиолетовый, эритроциты, мякотные оболочки нервов — в желтый или желто-красный, мышечные волокна — в ярко-оранжевый, роговое вещество эпидермиса — в ярко-красный цвет. Нередко перед ОМ рекомендуют окрасить ядра клеток кармином. Из модификаций ОМ наиболее распространена азановая окраска (модификация Гейденгайна в 1915 г). Ромейс [2] считает, что этот метод значительно превосходит окрашивание по Маллори «по стойкости, чёткости и надёжности». Однако, если читатель ознакомится с описанием азановой окраски, приводимой самим Ромейсом, то убедится в том, что она намного дольше и сложнее, чем метод Маллори, а оптимальными для неё считаются фиксаторы, содержащие ядовитую, проблематичную в приобретении, хранении и списании сулему. Применительно к методу Маллори, Ромейс также считает лучшими фиксаторами сулему или жидкость Ценкера, однако, исходя из нашего опыта, утверждая, что применение метода Маллори после фиксации в формалине «даёт неудовлетворительную окраску» [2], Ромейс не вполне корректен. Правильный выбор здесь будет зависеть от поставленных задач и цели вашей работы: разница в результатах между окрашиванием по Маллори и азановым методом Гейденгайна (тем более, при различной фиксации) может быть критична для тех, кто специализируется на изучении соединительной ткани или занимается клинической диагностикой, но она не имеет решающего значения, если использовать окрашивание по Маллори в качестве обзорного, как это делаем мы. Авторы авторитетного гистологического руководства под редакцией Банкрофта и Гэмбл справедливо считают, что в силу продолжительности времени окрашивания азановый метод Гейденгайна не может быть рекомендован для общего окрашивания соединительной ткани, однако он очень полезен для выявления «проволочных петель» (поражение ткани почки при системной красной волчанке в виде утолщения базальной мембраны клубочков) в биопсии почек при диагностике волчаночного нефрита [5].

Приготовление красителей и вспомогательных растворов.

1. 1% водный раствор кислотного фуксина:

Растворить 0.1 г. кислотного фуксина в 100 мл дистиллированной воды, профильтровать.

 

2. 1% раствор фосфорномолибденовой кислоты (ФМК)

Растворить 1 г. ФМК в 100 мл дистиллированной воды, перед использованием профильтровать. Раствор достаточно хорошо храниться, можно приготовить его 0.5-1 л и хранить в тёмном месте при комнатной температуре, а фильтровать только необходимое количество непосредственно перед применением. Стаканчик в проводке, в котором находится ФМК, для наилучшего её сохранения следует обернуть чёрной бумагой (под действием света раствор зеленеет и теряет свои свойства). Также считается, что при работе с ФМК нельзя пользоваться металлическими предметами [3].

3. Красящий раствор Маллори:

Последовательно растворить в 100 мл дистиллированной воды: анилинового синего - 0.5 г., оранжевого Ж (orange G) – 2 г, щавелевой кислоты – 2 г. Раствор нагреть до кипения, остудить и профильтровать (Ромейс рекомендует так же поступать с раствором красителя после длительного хранения [2]). Нагревать этот краситель до кипения следует медленно и осторожно, стеклянную посуду для приготовления краски выбирать термостойкую, широкогорлую и с запасом по объёму, поскольку краситель бурно вскипает.

Окрашивание.

1. Депарафинирование срезов и доведение их до воды. Осуществляется погружением стёкол последовательно в 3 порции ксилола, 3 порции 96° спирта, и 1 порцию 70° спирта - на 3 мин в каждую. При низкой температуре в помещении (менее 22°С) или большой толщине срезов (более 10 мкм) пребывание стёкол в каждой порции ксилола рекомендуется увеличить до 4-5 мин. Затем перенести стёкла в дистиллированную воду на 1-2 мин. Долго держать срезы в 70⁰ спирте и воде не следует, поскольку они могут набухать и при недостаточном качестве наклеивания полностью или частично отделяться от стёкол.
2. Окрашивание в 0.1% водном растворе кислотного фуксина. Ромейс рекомендует окрашивать в нём 3 мин [2], Коржевский – 1-5 мин [3]. Лучше предварительно подобрать время окрашивания на пробных стёклах – в некоторых случаях может оказаться достаточным несколько окунаний или 10-15 секунд. Во время 2х следующих этапов (ополаскивание в воде и дифференцировка в ФМК) будет происходить частичное вымывание фуксина, поэтому при подборе времени окрашивания следует немного перекрашивать срезы по сравнению с желаемым оттенком.
3. Короткая промывка в дистиллированной воде (1-2 окунания, долго не держать, т.к. фуксин в воде хорошо вымывается).
4. Дифференцировка и фиксация окраски в 1% водном растворе ФМК. Ромейс рекомендует погружение стёкол в ФМК на 3-5 мин, в прописи Коржевского этот этап вообще отсутствует. Мы обычно дифференцируем в ФМК около 1 мин.

Как дистиллированная вода, так и ФМК, загрязняются вымывающимся из срезов фуксином, поэтому их следует заменять по мере необходимости.

5. Короткое ополаскивание в дистиллированной воде (1-2 окунания).
6. Окрашивание в растворе Маллори. Ромейс рекомендует окрашивать в течение 2х минут, Коржевский 10-60 мин (приготовление красителя по Коржевскому отличается от классического, изложенного у Ромейса: см. [2, 3]). На самом деле его также оптимально отрабатывать на пробных срезах – обычно бывает достаточно 10-40 секунд. Чтобы дифференцировочные спирты, следующие за этим этапом, быстро не загрязнялись, краситель следует максимально слить со стекла и протереть спинку стекла тканью. На слив большей части раствора красителя с одного предметного стекла уходит 5-7 секунд, следует учитывать это время при подборе режима окрашивания. При окрашивании большого количества стёкол можно использовать короткое ополаскивание в дистиллированной воде перед дифференцировкой в спиртах.
7. Дифференцировка в 96⁰ или 100⁰ спирте. Мы используем 3 смены спиртов, обычно большая часть краски отходит в первом из них, поэтому в нём можно держать 0.5-1 мин, в 2-х последующих – 3-5 мин. или дольше – пока не перестанут отходить облачка краски.
8. Окончательное обезвоживание и просветление срезов. Достигается погружением стёкол со срезами в 1 порцию смеси абсолютного или 96° спирта с ксилолом в соотношении 1:1, а затем последовательно в 3 порции ксилола.
9. Заключение в канадский бальзам или его аналоги, такие как Shandon Synthetic Mountant на основе толуола (Thermo Electron Corporation, UK). Преимущество последнего состоит в том, что он прозрачен (в отличие от желтоватого канадского бальзама) и в нём дольше сохраняется окрашивание.

Литература:

1. Boon, Mathilde E.; Drijver, Johanna S. (1986). Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.
2. Ромейс Б. Микроскопическая техника / под ред. И.И. Соколова. – М.: Изд-во Иностранной Литературы, 1954. – 718 с.
3. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии: руководство / под ред. Д.Э. Коржевского. – СПб.: СпецЛит, 2013. 127 с.
4. Wołuń-Cholewa, Maria; Szymanowski, Krzysztof; Andrusiewicz, Mirosław; Szczerba, Anna; Warchoł, Jerzy B. (2010). "Trichrome Mallory's stain may indicate differential rates of RNA synthesis in eutopic and ectopic endometrium". Folia Histochemica et Cytobiologica. 48(1): 148–152. doi:2478/v10042-008-0106-4
5. Theory and Practice of Histological Techniques, Ed. by J.D. Bancroft and M. Gamble, 5^th, Edinburgh, 2002, 796 p.
6. Большая Медицинская Энциклопедия / под ред. Б.В. Петровского, Т.26, издание 3, ‑ М.: «Советская Энциклопедия», 1977. ‑ С.449.
7. CONN’S Biological Stains: A Handbook of Dyes, Stains and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine, 10^th Ed. by R.W.Horobin and J.A.Kiernan. Oxford, 2002, 555 p.
8. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / под ред. В.В. Португалова. – М.: МИР, 1969. 645 c.