1. Главная
2. О проекте

NeuN

 

9-10	11-12	12-13	13-14	14-15	15-16	16-17	19-20	21-22	23-24	26-27	29-30
	+				+				+		+

NeuN (синонимы: Fox-3, Rbfox3 или гексарибонуклеотид-связывающий белок-3) – член семейства Fox-белков, гомолог белкового продукта гена определяющего пол у нематоды Caenorhabditis elegans - представляет собой нейрональный ядерный антиген, который обычно используется в качестве биомаркера для нейронов.

 

Реакция на ядерный антиген нервных клеток NeuN является более современной и совершенной альтернативой методу Ниссля, хотя в ряде случаев (см. ниже) получить однозначный ответ на вопрос о состоянии нейронов можно только путём их совместного применения [1]. Она наиболее распространена в экспериментальных исследованиях, что связано с достаточно быстрым посмертным катаболизмом белка NeuN. В патоморфологических исследованиях реакцию на NeuN можно использовать в качестве теста для выявления ранних аутолитических изменений нервной ткани при решения вопроса о возможности диагностического иммуногистохимического исследования[2].

Впервые NeuN был описан в 1992 г. Муллен и соавторами, которые создали серию моноклональных антител к мышиным антигенам с первоначальным намерением найти мышиные специфические иммунологические маркеры для использования в экспериментах по трансплантации [3]. Была выделена гибридомная линию, продуцировавшая моноклональное антитело mAb A60, которое, как оказалось, связывает антиген, характерный, по-видимому, для всех позвоночных, который экспрессируется только в ядрах и в меньшей степени – в цитоплазме нейронов [4]. Поэтому антиген был известен как NeuN, что означает Neuronal Nuclei (нейрональные ядра), хотя белок, с которым связывалось антитело A60, оставался неизвестным в течение следующих 17 лет. В 2009 году Ким и соавторы использовали протеомные методы, чтобы показать, что NeuN является членом семейства Fox-белков и соответствует белку, известному как Fox-3 или Rbfox3, гомологу белка млекопитающих Fox-1, первоначально идентифицированному в ходе генетических исследований червя-нематоды C. elegans [5] (у этой нематоды белок Fox-1 связан с определением пола, а Fox является аббревиатурой английского "Feminizing locus on X" [4]). Из [3] следовало, что экспрессия NeuN связана с нейрональной дифференцировкой и сохраняется в течение всей жизни клетки, а значит NeuN является постоянным регулятором общих проявлений нейронального фенотипа. Конкретные функции этого белка в нервных клетках долгое время оставались непонятными.

ДНК-связывающие свойства NeuN и его преимущественная локализация в клеточном ядре позволил предположить, что NeuN является нейроспецифической нейрорегуляторной молекулой [1, 3]. Позднее подтвердилось предположение об участии NeuN в формировании аксонов нервных клеток, поскольку аксональное повреждение приводило к почти полной потере NeuN-иммунореаутивности в мотонейронах лицевого нерва [6].

Внутриядерное распределение NeuN/Fox-3 соответствует представлению о роли данного белка как фактора сплайсинга, присутствующего и в нуклеоплазме, и в составе спеклов (от англ. speckles – пятнышки, крапинки) – структур, которые расположены в межхроматиновых областях ядер клеток млекопитающих и известны как места концентрирования факторов сплайсинга [1].

Информация о функциях NeuN/Fox-3 до сих пор не отличается полнотой и ясностью, а вопрос о его роли в нервных клетках продолжает оставаться открытым. Одним из наиболее интригующих противоречий является его неоднократно подтверждённое отсутствие в клетках Пуркинье коры мозжечка млекопитающих, а также в звёздчатых клетках и клетках Гольджи мозжечка, в обонятельных митральных клетках, фоторецепторах сетчатки и гамма-мотонейронах спинного мозга [1, 4]. Однако подавляющее большинство нейронов сильно NeuN-положительны, и иммунореактивность NeuN широко используется для идентификации нейронов в культуре ткани и в срезах, а также для измерения соотношения нейрон/глия в различных областях мозга [7]. Экспрессия NeuN становится очевидной по мере созревания нейронов, как правило, после снижения в них экспрессии даблкортина (Doublecortin, DCX), маркера, наблюдаемого на самых ранних стадиях развития нейронов [4].

Несмотря на неопределённость функций NeuN, иммуноцитохимическая реакция на этот белок в настоящее время широко и успешно используется в нейрофизиологических исследованиях для маркирования нейронов и оценки степени нейродегенерации. Одной из областей применения реакции на NeuN являются исследования ишемического поражения головного мозга при создании новых моделей ишемии [1]. Для исследования постишемической нейродегенерации ИГХ-окрашивание на NeuN является методом выбора, позволяющим эффективно оценить состояние нервных клеток. Также реакция на NeuN может быть использована для определения размеров ишемического очага.

Многомаркерная визуализация популяций нейронов, экспрессирующих различные нейропротекторные факторы – другая задача, для решения которой используется NeuN. Также эта реакция применяется при исследовании гипоксических состояний. Окрашивание клеток на NeuN позволяет изучать последствия внутриутробных воздействий, таких, как хроническая пренатальная гипоксия, приводящих к структурным изменениям в головном мозге. Реакция на NeuN может быть эффективна и при изучении токсических воздействий на головной мозг [1].

Однако несмотря на широкое использование ИГХ-реакции на NeuN в нейрофизиологии, у этого метода существует ряд ограничений. Первое из них состоит в том, что, как было сказано выше, NeuN экспрессируется у млекопитающих не во всех типах нейронов. Вторым ограничением является то, что в чёрном веществе головного мозга различных лабораторных животных и человека нейроны в норме могут давать лишь слабую реакцию на NeuN, а часть из них может оставаться иммунонегативной. Третье ограничение состоит в том, что хотя раннее исчезновение реакции на NeuN всегда свидетельствует о поражении нервных клеток, эта реакция может быть обратимой и она не всегда свидетельствует о гибели NeuN-негативных клеток [9]. Уточнить, вызвано ли исчезновение реакции на NeuN гибелью нейронов, или обусловлено лишь их повреждением, можно, использовав окрашивание по Нисслю.

С учётом перечисленных ограничений, NeuN является надёжным маркёром функционального состояния нервных клеток, который, в сочетании с окрашиванием по Нисслю, позволяет дать объективное заключение о повреждении или гибели нервных клеток вследствие экспериментального воздействия или эндогенного патологического процесса.

 

Для выявления NeuN (neuronal nuclear antigen) – нейронального ядерного белка - использовали кроличьи поликлональные антитела: Rabbit Polyclonal Antibody, Thermo Scientific, Prod # PA5-56560, Lot #C91950, а также мышиные моноклональные антитела: Mouse Monoclonal Antibody, Millipore, MAB377, Lot #LV1573084 и Lot #3124149;

Реакция проводилась с термическим демаскированием антигенов в цитратном буфере (рН 6.0) (см. пропись ниже).

Визуализацию результатов иммуногистохимического окрашивания осуществляли с помощью UltraVision Quanto Detection System (HRP Polymer) или Ultra Vision LP Detection System, HRP Polymer (RTU) с диаминобензидином в качестве хромогена (Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA, USA). Для выявления NeuN также можно использовать вторичные антитела, связанные с флуорохромом, однако такая реакция будет менее чувствительной по сравнению с реакциями, в которых используется ферментная метка [1] (мы этот подход не использовали).  В каждом случае растворы, входящие в набор визуализирующей системы использовались в соответствии с рекомендациями производителя.

 Подготовка материала:

 Согласно Д.Э. Коржевскому, оптимальные результаты при выявлении NeuN получаются при использовании материала, фиксированного в цинк-этанол-формальдегиде в течение 18-24 ч. [9]. По мнению автора, такая непродолжительная фиксация является достаточно мягкой и позволяет получить препараты, пригодные для постановки ИГХ реакции на NeuN без теплового демаскирования антигена. Однако мы работаем с коллекционным материалом, где образцы для длительного хранения содержатся в забуференном параформальдегиде (pH 7,2-7,4). Фиксация в спиртах может приводить к сильному сжатию образцов головного мозга от плодов человека. Кроме формалиновой фиксации в нашей коллекции применялась фиксация по методу Буэна, однако от нее отказались в силу специфики влияния на некоторые антигены и последующее выявление с помощью иммуногистохимии. Поэтому мы проводим ИГХ-выявление NeuN с термическим демаскированием.

При планировании исследований с NeuN важно учитывать, что он достаточно быстро катаболизируется в посмертный период, и этот процесс ускоряется при грубом механическом воздействии на нервную ткань, поэтому вскрытие полости черепа и извлечение головного мозга следует проводить с особой аккуратностью [1].

Обезвоживание мы осуществляли через смесь изопрепа с дистилированной водой повышающейся концентрации: от 50% до 100% изопрепа. Заливка в гистомикс с добавлением 5-10% воска.

 

Иммуногистохимическое окрашивание осуществлялось согласно следующей прописи:

 

1. Депарафинирование срезов и доведение их до воды. Осуществляется погружением стёкол последовательно в 3 порции ксилола, 3 порции 96° спирта, и 1 порцию 70° спирта - на 3 мин в каждую. При низкой температуре в помещении (менее 22°С) или большой толщине срезов (более 10 мкм) пребывание стёкол в каждой порции ксилола рекомендуется увеличить до 4-5 мин. Затем перенести стёкла в дистиллированную воду на 1-2 мин.
2. Инактивация эндогенной пероксидазы: 3% раствор H₂O₂ – 20 мин.
3. Ополаскивание стёкол в дистиллированной воде.
4. Термическое демаскирование антигенов – включало в себя следующие этапы:

• Разогрев цитратного буфера (рН 6.0) в микроволновке до закипания (8-10 мин. при 100 Вт;
• помещение в разогретый буфер стёкол со срезами;
• кипячение в микроволновке – 5 мин начиная с повторного закипания при 300 Вт;
• остывание в том же цитратном буфере при комнатной температуре – 20 мин.

5. Ополаскивание стёкол в PBS (pH2-7.6).
6. Разграничение срезов на стёклах: промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов для образования сухой поверхности, после чего обвести каждый срез специальным гидрофобным фломастером (Daco Pen, Liquid Blocker, PAP Pen и др. Также можно использовать тонкую свечку или заточенный наподобие карандаша брусок парафина).
7. UltraVision Protein Block. Покрыть каждый срез блокировочным раствором и оставить при комнатной температуре на 5 мин (в соответствии с протоколом производителя). Здесь и далее объём реактива, наносимого на срезы, определяется эмпирически в соответствии с размером срезов.
8. Погружение стёкол в PBS (pH2-7.6). После погружения аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.
9. Инкубация с первыми антителами: нанести на срезы необходимое количество первичных моноклональных мышиных антител. Мы использовали 3 варианта антител к NeuN: использовали кроличьи поликлональные антитела: Rabbit Polyclonal Antibody, Thermo Scientific, Prod # PA5-56560, Lot #C91950, а также мышиные моноклональные антитела: Mouse Monoclonal Antibody, Millipore, MAB377, Clone A60, Lot #LV1573084 и Lot #3124149. Во всех случаях рабочими разведениями были 1:100–1:300. Инкубация проводилась в течение ночи (Overnight) при +4°С во влажной камере. Может быть заменена на 2-3-часовую инкубацию во влажной камере при +36°С, однако по нашему опыту Overnight-инкубация при +4°С даёт лучшие результаты.
10. Отмывка первых антител: 4 смены PBS (pH2-7.6). В первой смене ополоснуть, во 2-4 сменах - по 10 мин. После отмывки – аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.
11. Усилитель первых антител (Primary Antibody Amplifier Quanto или Primary Antibody Enchancer LP) – 10 мин.
12. Отмывка усилителя первых антител: 4 смены PBS (pH2-7.6). В первой смене ополоснуть, во 2-4 сменах - по 10 мин. После отмывки – аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.
13. HRP Polymer Quanto или Large Volume HRP Polymer (LP) – 15 мин. в тёмных камерах.
14. Отмывка HRP Polymer: 4 смены PBS (pH2-7.6). В первой смене ополоснуть, во 2-4 сменах - по 10 мин. После отмывки – аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.
15. Диаминобензидин (DAB) свежеприготовленный в соответствии с рекомендациями производителя из набора Ultravision Plus Detection System: Large Volume DAB Plus Substrate System (RTU) (Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA, USA) – 8 мин.
16. Ополаскивание в PBS (pH2-7.6).
17. Ополаскивание в дистиллированной воде.
18. Обезвоживание (по 5 мин. в каждом растворе):

• 1 порция 70° спирта;
• 3 порции 96° спирта;
• Смесь 96° спирт-ксилол в соотношении 1:1.
• 2 порции ксилола.

19. Заключение в канадский бальзам или его аналоги (Shandon Synthetic Mountant, полистирол, пермаунт, DPX или другие подобные среды).

Результат: в результате проведения реакции ядра нейронов – коричневые. Однако в ряде случаев NeuN-позитивной может оказываться и цитоплазма нейронов [3, 13]. Причиной такой неожиданной выявляемости ядерного маркёра могут быть как существование гипотетических изоформ белка NeuN (46 и 48 кДа) с различной внутриклеточной локализацией [13], так, возможно, и те его функции, которые до сих пор остаются неизвестными

Для подробного описания альтернативного варианта иммуногистохимической реакции на NeuN по Д.Э. Коржевскому см. [2].

Литература:

1. Молекулярная нейроморфология. Нейродегенерация и оценка реакции нервных клеток на повреждение / Д.Э. Коржевский, И.П. Григорьев, Е.А. Колос и др.; под ред. Д.Э. Коржевского. ‑ СПб.: СпецЛит, 2015. – 110c.
2. Сухорукова Е.Г., Кирик О.В., Зеленкова Н.М. и др. Нейрональный ядерный антиген NeuN – показатель сохранности нервной ткани и пригодности её для иммуногистохимического исследования. Медицинский академический журнал.. 2015. Т.15. №1. С.63-67.
3. Mullen, RJ; Buck, CR; Smith, AM (1992). "NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates". 116 (1): 201–11. doi:10.1242/dev.116.1.201
4. From Wikipedia, the free encyclopedia. https://en.wikipedia.org/wiki/NeuN#cite_note-pmid1483388-1
5. Kim, KK; Adelstein, RS; Kawamoto, S (2009). "Identification of neuronal nuclei (NeuN) as Fox-3, a new member of the Fox-1 gene family of splicing factors". Journal of Biological Chemistry. 284 (45): 31052–61. doi:1074/jbc.M109.052969
6. McPhail L. T. et al. Axotomy abolishes NeuN expression in facial but not rubrospinal neurons //Experimental neurology. – 2004. – Т. 185. – №. – С. 182-190.
7. Herculano-Houzel, S; Lent, R (2005). "Isotropic Fractionator: A Simple, Rapid Method for the Quantification of Total Cell and Neuron Numbers in the Brain". Journal of Neuroscience. 25 (10): 2518–21. doi:1523/JNEUROSCI.4526-04.2005
8. Ünal-Çevik I. et al. Loss of NeuN immunoreactivity after cerebral ischemia does not indicate neuronal cell loss: a cautionary note //Brain research. – 2004. – Т. 1015. – №. 1-2. – С. 169-174.
9. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии: руководство / под ред. Д.Э. Коржевского. – СПб.: СпецЛит, – 127c.
10. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии: руководство / под ред. Д.Э. Коржевского. 2-е издание, исправленное и дополненное. – СПб.: СпецЛит, 2014. – 119 с.
11. Gusel'Nikova V. V., Korzhevskiy D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker //Acta Naturae (англоязычная версия). – 2015. – Т. 7. – №. 2 (25). – С. 42-47.