1. Главная
2. О проекте

окраска по Нисслю

 

9-10	11-12	12-13	13-14	14-15	15-16	16-17	19-20	21-22	23-24	26-27	29-30
	+				+	+	+	+	+	+	+

Окрашивание нервных клеток по Нисслю.

Метод Ниссля представляет собой способ гистологической окраски нервной ткани, при котором хроматофильная субстанция нейронов (вещество Ниссля, тигроид или тигроидное вещество) окрашивается с помощью анилиновых красителей [1]. Предложен Нисслем (F. Nissl, нем. невропатолог и психиатр, 1860—1919) в 1894 г. Наряду с импрегнацией серебром, широко применяется для изучения нервной ткани как в норме, так и при патологии, позволяет косвенно судить о нормальном состоянии и патологических изменениях в нервных клетках (флоккуляция тигроида, тигролиз, вакуолизация цитоплазмы и др.), а также в глиальных элементах [2].

Гранулы вещества Ниссля могут быть визуализированы с помощью многих основных красителей, таких, как нейтральный красный, метиленовый синий, азур, пиронин, тионин, толуидиновый синий и крезилвиолет [3]. Варьируя способы окрашивания, рН и продолжительность дифференцировки, можно добиться как окрашивания исключительно вещества Ниссля, так и ядер нейронов и глиальных клеток [3]. На парафиновых срезах наилучшие результаты дают толуидиновый синий, тионин и крезиловый фиолетовый (крезилвиолет), а с помощью красителя Neuro-Trace (Molecular Probes) можно осуществлять флуоресцентный аналог окрашивания по Нисслю [1].

При этом увидеть общую архитектуру нейронов позволяет даже рутинное окрашивание гематоксилином и эозином. Гематоксилин в сочетании с окрашиванием по Ван-Гизону широко используется при окрашивании нейронов, поскольку позволяет выявить сосудистые изменения, миелиновые оболочки и другие структуры клеток [3]. Однако для оценки состояния нервных клеток при гистологическом исследовании стандартного окрашивания гематоксилином и эозином может оказаться недостаточно, поскольку после формалиновой фиксации нервная ткань обладает значительной эозинофилией, которая может маскировать такие изменения нейронов, как гиперхроматоз и хроматолиз, а также делает неразличимыми небольшие скопления липофусцина [1]. Главное преимущество окрашивания по Нисслю состоит в том, что оно может быть использовано не только для выявления субстанции Ниссля, но и для визуализации структуры клетки [3]. Именно поэтому метод Ниссля, является «золотым стандартом» неврологических исследований и как нейрогистологический способ окрашивания используется в тех случаях, когда необходимо более точно оценить состояние ядра и цитоплазмы нейронов.

Со временем метод модифицировался и претерпел ряд упрощений [4], мы применяем пропись, близкую к оригинальной, но также несколько видоизменённую для наших целей и условий работы. В качестве красящего вещества используем крезиловый фиолетовый.

Крезиловый фиолетовый (синонимы: cresyl violet, cresyl violet acetate, oxazine 9; родственными красителями являются cresyl echt violet и cresyl fast violet) – органическое соединение с химической формулой C₁₈H₁₅N₃O₃, основной анилиновый (оксазиновый) краситель [5, 6]. Коричнево-зелёный порошок, плохо растворимый в воде и спирте. Помимо окрашивания по Нисслю в нейроанатомических исследованиях, этот краситель может быть использован для количественной нейровизуализации с помощью планшетного сканирования, для выявления Helicobacter и полового хроматина, а также для прижизненного окрашивания во время эндоскопических процедур [5]. Концентрированные растворы крезилового фиолетового используются также для выявления слизи, кератогиалина и рогового вещества в эпидермисе, а слабые растворы применяют для прижизненной окраски мелких объектов (яйцеклетки, зародыша и т.п.), метахроматических структур (например, гранул тучных клеток), а также для суправитального окрашивания тромбоцитов и ретикулоцитов крови [6]. Идентичность крезилового фиолетового, cresyl violet acetate, cresyl echt violet и cresyl fast violet зависит от даты и места производства, подробнее см. [5].

Подготовка материала.  Метод Ниссля отличается постоянством и большой надежностью результатов. Основой его успешного использования являются правильная фиксация материала и, что особенно важно, тщательное обезвоживание в спиртах восходящей концентрации при заливке в целлоидин или парафин. При несоблюдении этих условий препараты дают неотчетливое изображение, имеют зеленый оттенок и быстро обесцвечиваются [7]. Лучшие результаты метод Ниссля даёт при фиксации нервной ткани в 100⁰ или 96⁰ этаноле [1-4; 7-10]. Согласно [3], можно также использовать жидкость Карнуа, или забуференный формалин. Д.Э. Коржевский пишет, что вполне допустима первоначальная кратковременная фиксация в формалине (до суток) с последующей фиксацией и обезжириванием в этаноле (3-5 суток со сменой этанола [1]. Для более подробного описания особенностей фиксации при окрашивании по Нисслю см. [9]

Мы работаем с коллекционным материалом, где образцы для длительного хранения содержатся в забуференном параформальдегиде (pH 7,2-7,4). Фиксация в спиртах может приводить к сильному сжатию образцов головного мозга от плодов человека. Кроме формалиновой фиксации в коллекции применялась фиксация по методу Буэна, однако от нее отказались в силу специфики влияния на некоторые антигены и последующее выявление с помощью иммуногистохимического метода.

Обезвоживание осуществляется через смесь изопрепа с дистилированной водой повышающейся концентрации: от 50% до 100% изопрепа. Заливка в гистомикс с добавлением 5-10% воска.

Результат: Метод Ниссля основан на перекрашивании фиксированных в спирте срезов основным анилиновым красителем с последующим отмыванием его избытка спиртом. При этом тела клеток сильнее удерживают краситель, чем нервные волокна, которые отмываются быстрее [4]. В результате интенсивно окрашенный клеточный материал резко выделяется на бесцветном фоне: глыбки, или вещество Ниссля, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые; цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно-синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено или слабо подкрашено.

Приготовление красителя.

Мы используем следующий способ приготовления: 1 г. крезилового фиолетового растворить в 1 л. холодной дистиллированной воды с последующим нагреванием на водяной бане в течение 6 ч (без добавления уксусной кислоты). После этого в течение 7 дней выдерживать раствор при комнатной температуре в открытой, затянутой марлей колбе. Перед употреблением профильтровать. Другие способы приготовления раствора красителя – см. [1, 4, 8]. Сейчас также существуют готовые фирменные красители для метода Ниссля.

Окрашивание (способ, используемый в нашей лаборатории; другие способы - см. [1, 4, 8].

1. Депарафинирование срезов и доведение их до воды. Осуществляется погружением стёкол последовательно в 3 порции ксилола, 3 порции 96° спирта, и 1 порцию 70° спирта - на 3-5 мин в каждую. При низкой температуре в помещении (менее 22°С) или большой толщине срезов (более 10 мкм) пребывание стёкол в каждой порции ксилола рекомендуется увеличить до 4-5 мин. Затем перенести стёкла в дистиллированную воду на 1-2 мин. Долго держать срезы в 70⁰ спирте и воде не следует, поскольку они могут набухать и частично или полностью отделяться от стёкол.
2. Погружение стёкол при комнатной температуре срезами вниз в раствор красителя, налитый в термостойкую фарфоровую плошку.
3. Нагрев плошки со стёклами на электрической печке или газовой горелке через асбестовую пластинку до температуры +50-55⁰С (до отхождения паров).
4. Сразу после достижения указанной температуры или появления паров – снятие плошки с подогрева, сразу после этого - извлечение стёкол и ополаскивание их в дистиллированной или водопроводной воде. Если после этого планируется окрашивание следующей партии стёкол, краску рекомендуется остудить до 30-35⁰С, после чего процесс можно повторить.
5. Дифференцировка. Осуществляется проводкой стёкол через серию спиртов:

• 40⁰ спирт – около 5 мин;
• 70⁰ спирт – длительно, под визуальным контролем гистолога, время определяется эмпирически и отрабатывается на пробных срезах, при недостаточной степени отмывки применяется дополнительное отмывание в солянокислом спирте (на 100 мл 70⁰ спирта – 3-5 капель концентрированной соляной кислоты). Как правило, достаточно на несколько секунд погрузить срезы в солянокислый спирт - также под контролем гистолога;
• 96⁰ спирт – 3 смены, по 3-5 мин. в каждой.

6. Продолжение дифференцировки и обезвоживание: смесь 96°спирта с ксилолом в соотношении 1:1 – около 3х мин.
7. При недостатке времени после п.6 можно провести через две смены ксилола по 3-5 мин. и заключать в бальзам. Для достижения оптимального результата – продолжение дифференцировки и просветление срезов после п.6: смеси эвгенола (гвоздичного масла) и ксилола в соотношениях (эвгенол:ксилол)

• 1:9
• 1:4
• 1:2
• чистый эвгенол

В каждой смеси – по 5-10 мин. В чистом эвгеноле под контролем гистолога – на срок от несольких часов до нескольких дней (в среднем – на ночь).

8. Отмывка от эвгенола. Достигается обратной проводкой стёкол от чистого эвгенола с понижением его концентрации до чистого ксилола (см. п.7).
9. Заключение в канадский бальзам или его аналоги, такие как Shandon Synthetic Mountant на основе толуола (Thermo Electron Corporation, UK). Преимущество последнего состоит в том, что он прозрачен (в отличие от желтоватого канадского бальзама) и в нём дольше сохраняется окрашивание.

Литература:

1. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии: руководство / под ред. Д.Э. Коржевского. – СПб.: СпецЛит, 127с.
2. Большая Медицинская Энциклопедия / под ред. Б.В. Петровского, Т.17, издание 3, ‑ М.: «Советская Энциклопедия», 1977. – 511с.
3. Theory and Practice of Histological Techniques, Ed. by J.D. Bancroft and M. Gamble, 5^th, Edinburgh, 2002, 796p.
4. Ромейс Б. Микроскопическая техника / под ред. И.И. Соколова. – М.: Изд-во Иностстранной Литературы, 1954. – 718 с.
5. CONN’S Biological Stains: A Handbook of Dyes, Stains and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine, 10^th Ed. by R.W.Horobin and J.A.Kiernan. Oxford, 2002, 555p.
6. Большая Медицинская Энциклопедия / под ред. Б.В. Петровского, Т.11, издание 3, ‑ М.: «Советская Энциклопедия», 1977. – 544с.
7. Микроскопическая техника. http://labx.narod.ru/documents/staining_nervous_tissue.html
8. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / под ред. В.В.Португалова. – М.: МИР, 1969. - 645c.
9. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. – Л.: Медицина, 1969. – 423с.
10. Лаборатория экспериментальной патоморфологии. http://histopathology.narod.ru/documents/method_nisslya.html