1. Главная
2. О проекте

Виментин

 

9-10	11-12	12-13	13-14	14-15	15-16	16-17	19-20	21-22	23-24	26-27	29-30
	+	+		+	+	+	+	+	+	+	+

Виментин (Vimentin) является структурным белком, относится к глиальным маркёрам и представляет собой цитоплазматический белок промежуточных филаментов (ПФ) III типа.

Название виментина происходит от латинского vimentum, что в большинстве англоязычных источников переводится как «набор гибких стержней» (array of flexible rods) [1-4], Google переводчиком – как «трава», а латинско-русским словарём 1986 года – как «плетение, плетёный щит, фашина (связка хвороста, сноп, вязанка прутьев)» [5]. Виментин был выделен из мышиных фибробластов 3Т3 в 1978 г [3]. Благодаря ИГХ-исследованиям, установлено, что он содержится в клетках культур эндотелиоцитов, фибробластов и других немышечных клетках мезенхимного происхождения. Считается наиболее изученным из белков ПФ. Может формировать как гомо-, так и гетерополимеры с другими белками III типа и с низкомолекулярными белками нейрофиламентов. В клетке обладает способностью к самосборке в филаменты толщиной 8-12 нм.

Благодаря пластичности и способности принимать разные формы, виментин способствует сохранению целостности клеток и отвечает за изменение их формы. Участвует в распределении органелл, и обеспечивает их правильную локализацию в клетке [7]. Первоначально считалось, что виментин выявляется только в мезенхимных клетках, но позднее было установлено, что это не так. В течение эмбрионального развития его можно обнаружить во многих клеточных типах [4, 8], в частности – в предшественниках основных клеточных типов ЦНС – радиальных глиоцитах [9]. Его синтезируют предшественники мышечных клеток большинства позвоночных, а также эпителиальные клетки почки человека на ранних стадиях развития. По мере взросления синтез прекращается, однако в условиях регенерации после повреждения (например, ишемии) эти клетки снова начинают экспрессировать виментин, что позволяет считать его маркёром клеточной дифференцировки [10].

Как и другие ПФ, виментин используется как маркёр опухолевых клеток, однако он обнаруживается  практически во всех мезенхимальных опухолях и, таким образом, имеет минимальное значение для идентификации конкретных опухолей [3, 8]. При этом он очень полезен как контрольный маркер, указывающий на то, что ткань была должным образом сохранена и обработана, т.е. может быть использована для клинической диагностики. Отсутствие иммунопозитивности к виментину в неопухолевых эндотелиальных клетках, фибробластах и других мезенхимальных элементах, обычно присутствующих в любом срезе ткани, свидетельствует о значительном повреждении тканевых антигенов или о некорректной постановке реакции [2, 3].

В исследованиях ЦНС виментин используется как маркёр клеток-предшественников и клеток астроглиальной природы, являясь удобной моделью исследования глиогенеза в норме и патологии. При разных патологиях мозга (травме, ишемии, нейродегенеративных заболеваниях) зрелые астроциты начинают реэкспрессировать виментин, что указывает на развитие реактивного глиоза [6]. В ряде случаев отсутствие экспрессии виментина также может быть ключом к диагностике редких виментин-негативных мезенхимальных опухолей, таких как альвеолярная саркома мягких тканей и новообразования периваскулярных эпителиоидных клеток [8].

С биологической точки зрения интересна видовая специфичность экспрессии виментина. Так, известно, что его синтез отсутствует в эпендимоцитах головного мозга человека, но обязательно присутствует в аналогичных клетках у крыс [11].

 

 

Для выявления виментина мы использовали Rabbit Monoclonal Antibody, Invitrogen, Clone SP20, Prod #MA5-14564, Lot #RI2268461D.

С помощью ИГХ выявление виментина возможно как на криостатных, так и на парафиновых срезах. Однако в ткани, фиксированной формалином, окрашивание виментином может быть ослаблено, приводя к противоречивым результатам [12]. Избежать этого помогает использованное нами термическое демаскирование антигена, в цитратном буфере (рН 6.0) (см. пропись ниже).

Визуализацию результатов иммуногистохимического окрашивания осуществляли с помощью UltraVision Quanto Detection System (HRP Polymer) или Ultra Vision LP Detection System, HRP Polymer (RTU) с диаминобензидином в качестве хромогена (Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA, USA). В каждом случае растворы, входящие в набор визуализирующей системы использовались в соответствии с рекомендациями производителя.

 Подготовка материала:

 Мы работаем с коллекционным материалом, где образцы для длительного хранения содержатся в забуференном параформальдегиде (pH 7,2-7,4). Фиксация в спиртах может приводить к сильному сжатию образцов головного мозга от плодов человека. Кроме формалиновой фиксации в нашей коллекции применялась фиксация по методу Буэна, однако от нее отказались в силу специфики влияния на некоторые антигены и последующее выявление с помощью иммуногистохимии.

Обезвоживание мы осуществляли через смесь изопрепа с дистилированной водой повышающейся концентрации: от 50% до 100% изопрепа. Заливка в гистомикс с добавлением 5-10% воска.

 

Иммуногистохимическое окрашивание осуществлялось согласно следующей прописи:

 

1. Депарафинирование срезов и доведение их до воды. Осуществляется погружением стёкол последовательно в 3 порции ксилола, 3 порции 96° спирта, и 1 порцию 70° спирта - на 3 мин в каждую. При низкой температуре в помещении (менее 22°С) или большой толщине срезов (более 10 мкм) пребывание стёкол в каждой порции ксилола рекомендуется увеличить до 4-5 мин. Затем перенести стёкла в дистиллированную воду на 1-2 мин.
2. Инактивация эндогенной пероксидазы: 3% раствор H₂O₂ – 20 мин.
3. Ополаскивание стёкол в дистиллированной воде.
4. Термическое демаскирование антигенов – включало в себя следующие этапы:

• Разогрев цитратного буфера (рН 6.0) в микроволновке до закипания (8-10 мин. при 100 Вт;
• помещение в разогретый буфер стёкол со срезами;
• кипячение в микроволновке – 5 мин начиная с повторного закипания при 300 Вт;
• остывание в том же цитратном буфере при комнатной температуре – 20 мин.

5. Ополаскивание стёкол в PBS (pH2-7.6).
6. Разграничение срезов на стёклах: промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов для образования сухой поверхности, после чего обвести каждый срез специальным гидрофобным фломастером (Daco Pen, Liquid Blocker, PAP Pen и др. Также можно использовать тонкую свечку или заточенный наподобие карандаша брусок парафина).
7. UltraVision Protein Block. Покрыть каждый срез блокировочным раствором и оставить при комнатной температуре на 5 мин (в соответствии с протоколом производителя). Здесь и далее объём реактива, наносимого на срезы, определяется эмпирически в соответствии с размером срезов.
8. Погружение стёкол в PBS (pH2-7.6). После погружения аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.
9. Инкубация с первыми антителами: нанести на срезы необходимое количество первичных моноклональных мышиных антител. Мы использовали кроличьи моноклональные антитела к виментину Rabbit Monoclonal Antibody, Invitrogen, Clone SP20, Prod #MA5-14564, Lot #RI2268461D с рабочими разведениями 1:300 – 1:400. Инкубация проводилась в течение ночи (Overnight) при +4°С во влажной камере. Может быть заменена на 2-3-часовую инкубацию во влажной камере при +36°С, однако по нашему опыту Overnight-инкубация при +4°С даёт лучшие результаты.
10. Отмывка первых антител: 4 смены PBS (pH2-7.6). В первой смене ополоснуть, во 2-4 сменах - по 10 мин. После отмывки – аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.
11. Усилитель первых антител (Primary Antibody Amplifier Quanto или Primary Antibody Enchancer LP) – 10 мин.
12. Отмывка усилителя первых антител: 4 смены PBS (pH2-7.6). В первой смене ополоснуть, во 2-4 сменах - по 10 мин. После отмывки – аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.
13. HRP Polymer Quanto или Large Volume HRP Polymer (LP) – 15 мин. в тёмных камерах.
14. Отмывка HRP Polymer: 4 смены PBS (pH2-7.6). В первой смене ополоснуть, во 2-4 сменах - по 10 мин. После отмывки – аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов.
15. Диаминобензидин (DAB) свежеприготовленный в соответствии с рекомендациями производителя из набора Ultravision Plus Detection System: Large Volume DAB Plus Substrate System (RTU) (Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA, USA) – 8 мин. При необходимости, срезы можно подкрасить гематоксилином (например, Джилла) с последующим подсинением в щелочной воде [6], но мы такое подкрашивание не проводили.
16. Ополаскивание в PBS (pH2-7.6).
17. Ополаскивание в дистиллированной воде.
18. Обезвоживание (по 5 мин. в каждом растворе):

• 1 порция 70° спирта;
• 3 порции 96° спирта;
• Смесь 96° спирт-ксилол в соотношении 1:1.
• 2 порции ксилола.

19. Заключение в канадский бальзам или его аналоги (Shandon Synthetic Mountant, полистирол, пермаунт, DPX или другие подобные среды).

Результат: в результате проведения реакции цитоплазма иммунопозитивных клеток окрашивается в коричневый цвет, ядра всех клеток при подкрашивании гематоксилином приобретают оттенки синего цвета.

Для подробного описания альтернативного варианта иммуногистохимической реакции на виментин по Д.Э. Коржевскому см. [6].

Литература:

1. https://en.wikipedia.org/wiki/Vimentin
2. Dabbs D.J., Immunohistology of Neoplasms of Soft Tissue and Bone in Diagnostic Immunohistochemistry, 2019.
3. Mark R. Wick, Jason L. Hornick, Immunohistology of Soft Tissue and Osseous Neoplasmsin Diagnostic Immunohistochemistry: Theranostic and Genomic Applications (Third Edition), Edited by David J. Dabbs. 2011
4. Lisa A. Cerilli, Mark R. Wick, Immunohistology of Soft Tissue and Osseous Neoplasms in Diagnostic Immunohistochemistry (Second Edition), 2006
5. Дворецкий И.Х. Латинско-русский словарь: ок. 50 000 слов. Издание 3е, исправленное. М.: «Русский язык», 1986, 840 с.
6. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии: руководство / под ред. Д.Э. Коржевского. 2-е издание, исправленное и дополненное. – СПб.: СпецЛит, 2014. – 119 с.
7. Katsumoto T, Mitsushima A, Kurimura T (1990). "The role of the vimentin intermediate filaments in rat 3Y1 cells elucidated by immunoelectron microscopy and computer-graphic reconstruction". Biology of the Cell. 68 (2): 139–46. doi:1016/0248-4900(90)90299-I
8. Goldblum J.R. Immunohistochemistry for Analysis of Soft Tissue Tumors, in Hoda S.A. Enzinger and Weiss’s soft tissue tumors. – 2020.
9. Иммуногистохимическое исследование головного мозга. Под ред. Д.Э. Коржевского. СПб: СпецЛит, 2016, 143 с.
10. Terzi F. et al. Normal tubular regeneration and differentiation of the post-ischemic kidney in mice lacking vimentin //The American journal of pathology. – 1997. – Т. 150. – №. – С. 1361.