Гематоксилин и эозин

9-10	11-12	12-13	13-14	14-15	15-16	16-17	19-20	21-22	23-24	26-27	29-30
		+					+	+		+

Обзорное окрашивание гематоксилином и эозином (ОГЭ).

ОГЭ является является традиционным, главным и наиболее широко используемым в научной работе и медицинской диагностике способом обзорного окрашивания гистологических и цитологических препаратов. За редкими исключениями, каждый исследуемый образец сначала подвергается ОГЭ, позволяющему визуализировать ядра и цитоплазму клеток, а также оценить их функциональное состояние [1]. Метод предполагает использование двух красителей: основного (гематоксилина) и кислого (эозина).

Гематоксилин относится к флавоноидам и имеет растительное происхождение. Его получают из эфирного экстракта кампешевого или кровавого дерева (Haematoxylon campechianum, от греч. haima – кровь и hylon – древесина). Сам по себе гематоксилин не обладает красящими способностями, приобретая их после окисления в гематеин, соединения которого с ионами металлов (алюминия, железа, меди, хрома, молибдена, ванадия) дают окрашенные вещества (гематоксилиновые лаки). Поскольку их приготовление начинается с гематоксилина, по традиции именно этот термин используется для названия красителя [2]. Окисление гематоксилина в гематеин (созревание раствора гематоксилина) происходит в течение 2—4 нед. Процесс можно ускорить, добавляя в раствор сильные окислители (йодноватокислый калий или натрий, перманганат калия, перекись водорода и т. п.) [3]. В зависимости от состава и способа приготовления красителя, существуют различные виды гематоксилина, которые можно разделить на несколько групп, в зависимости от того, какой металл используется в качестве протравы, взаимодействующей с гематеином (от неё зависит цвет окраски) [4]. Для ОГЭ применяют квасцовые (алюминиевые) гематоксилины, предусматривающие естественное созревание красителя. Из них нами был выбран гематоксилин Эрлиха, поскольку его отличают быстрота работы, высокая интенсивность окрашивания и большая продолжительность хранения раствора (до нескольких лет) [4, 5]. Интенсивное и чёткое окрашивание ядер гематоксилином Эрлиха выцветает значительно медленнее, чем полученное с помощью других квасцовых гематоксилинов [5].

Все квасцовые гематоксилины исходно окрашивают базофильные структуры (ядерный гетерохроматин, рибосомы и богатые рибонуклеопротеинами (РНП) участки цитоплазмы) в красный цвет, который превращается в знакомый фиолетово- или чёрно-синий при промывании срезов в слабом щелочном растворе. Обычная водопроводная вода, как правило, является достаточно щелочной, для того, чтобы осуществить это превращение, однако иногда необходимы щелочные растворы, такие как насыщенный раствор карбоната лития, 0.05% раствор аммиака в дистиллированной воде или так называемый заменитель водопроводной воды Скотта (Scott’s Tap Water: 2 г K₂CO₃ и 20 г MgSO₄ на 1 л дистиллированной воды) [5]. Процедура эта известна как дифференцировка или ‘bluing’.

Помимо клеточных ядер, гематоксилин Эрлиха прекрасно окрашивает муцины, включая мукополисахариды хряща, поэтому может быть рекомендован для окрашивания хрящевых и костных структур [5]. Он особенно полезен для окрашивания тканей, подвергавшихся воздействию кислоты (например, при декальцинации). Это актуально также для образцов, которые длительное время хранились в формалине, постепенно закисляющемся с течением времени, либо в кислых фиксаторах, таких, как раствор Буэна. Некоторые исследователи не рекомендуют использовать гематоксилин Эрлиха для криостатных срезов [4, 5]. Однако, по более современным данным Ларсон и соавторов [11], ОГЭ является самым широко используемым способом окрашивания в микрографической хирургии Мооса (Mohs micrographic surgery, MMS), которая считается золотым стандартом помощи при немеланомных раках кожи с локализацией на лице и шее [11, 12]. MMS позволяет эффективно удалять злокачественные клетки, успевшие выйти за пределы основной опухоли, максимально сокращая объем резецируемой ткани. Вероятность рецидива при этом падает, а эффективность и эстетический итог операции заметно улучшаются. В MMS операция обычно бывает непредсказуемой по времени и многоэтапной, причём после каждого этапа выполняется срочное гистологическое исследование с помощью ОГЭ на замороженных срезах, от качества которого зависят локализация и масштаб следующих резекций, результат операции в целом, и в конечном счёте, жизнь пациента. Эти данные позволяют заключить, что даже если использование криостатных срезов и ухудшает качество ОГЭ, то для постановки диагноза такое ухудшение не критично.

Несмотря на то, что Г может окрашивать базофильные структуры цитоплазмы, по большей части окрашивание цитоплазмы, а также матрикса соединительной ткани, при ОГЭ осуществляется кислым красителем эозином.

Эозин (от имени Эос – древнегреческой богини утренней зари) – общее название группы органических красителей, относящихся к флюоран-ксантоловым (триарилметановым) соединениям. Комбинация эозина с гематоксилином является оптимальной для демонстрации общей гистологической архитектуры тканей. Особая ценность эозина состоит в том, что при надлежащей дифференцировке он позволяет различать цитоплазму различных типов клеток, а также типы соединительнотканных волокон и внеклеточного матрикса, окрашивая их в различные оттенки [5] (см. ниже). Существуют варианты эозина, марки которых обозначают как Y, G и В, отличающиеся по химическому строению и растворимости в воде и спирте [3]. Мы используем сертифицированный для микроскопии эозин Y в форме натриевой соли (С₂₀H₆Br₄Na₂O₅), которая хорошо растворяется как в воде, так и в этаноле [4], несмотря на то, что этот эозин иногда называют водорастворимым [5]. Для рутинной работы мы обычно выбираем 0.1% водный раствор эозина [7], тогда как для срезов со слабой эозинофильностью могут быть использованы 0.5-1% водный [5] или 0.5% водно-спиртовой раствор эозина [4]. В зависимости от прочности связи красителя с разными компонентами ткани, а также времени окрашивания и дифференцировки (см. ниже раздел “Окрашивание”) цитоплазма, клеточные гранулы и соединительнотканные структуры могут окрашиваться в различные оттенки: от ярко-красного до золотисто-жёлтого. При использовании ОГЭ цитоплазма клеток с минимальным содержанием РНП будет лавандового цвета, тогда как зрелые эритроциты млекопитающих, в которых отсутствуют РНП, и сократимые белки мышц окрашиваются эозином в яркий красно-розовый или оранжевый цвет. Области применения эозина очень разнообразны: от селективного окрашивания минерализованной кости до диагностической оценки жизнеспособности сперматозоидов и визуализации изолированных клеток пищеварительной железы мидии [2].

= = = = = = = = = = = = =

ОГЭ – быстрый, простой и удобный способ гистологического окрашивания, который даёт хороший цветовой контраст и легко воспроизводится [9], однако его недостатком является невозможность различать цитоплазматические органеллы и многие другие тканевые компоненты. ОГЭ хорошо выявляет основные морфологические структуры клеток и тканей, но не является специфическим для каких-либо определенных химических соединений, поэтому идентификация окрашенных структур не всегда может быть достоверной [3]. Кроме того, гидрофобные структуры, такие как адипоциты, миелиновая оболочка аксонов и мембрана аппарата Гольджи, плохо окрашиваются ГЭ и требуют применения других методов [8], таких, как окрашивание по Нисслю (см. ниже).

Приготовление растворов красителей.

Гематоксилин Эрлиха:

Гематоксилин – 2 г.

Абсолютный [4, 5] или 96° [4, 8] спирт – 100 мл.

Глицерин – 100 мл.

Дистиллированная вода – 100 мл.

Ледяная уксусная кислота – 10 мл.

Алюмокалиевые квасцы – 3-15 г. ([8] – 3г, [4] – 10-12 г, [5] – около 15 г.)

Гематоксилин растворяют в спирте, после чего добавляют другие реактивы [5]. Коржевский [4] рекомендует отдельно растворить 10-12 г. калийных квасцов в 100 мл. воды при нагревании до 50-60°C, смешать этот раствор со спиртовым раствором гематоксилина, после чего добавить глицерин и ледяную уксусную кислоту [4]. Глицерин добавляется для замедления окислительных процессов и повышения стабильности раствора [5, 9], спирт препятствует росту плесени [9]. Рекомендуется естественное созревание при комнатной температуре, доступе воздуха и солнечного света в течение 14 дней [7] – 2 месяцев [4, 5]. Созревание раствора можно ускорить добавлением йодата натрия в количестве 50 мг на каждый грамм гематоксилина [4]. Коржевский советует добавлять йодат натрия (100 мг для нашей прописи) перед добавлением глицерина (после смешивания спиртового раствора гематоксилина и водного раствора квасцов), разведя его предварительно в 3-5 мл воды, нагретой до 30-40°С. В этом случае окрашивание можно производить в день приготовления раствора, однако продолжительность его хранения сильно уменьшается [4, 5], поэтому мы этот приём не используем. Перед окрашиванием профильтровать.

Эозин:

Растворить необходимое количество (мы используем 0.1 г) эозина в 100 мл дистиллированной воды комнатной температуры (по Коржевскому – 1 г эозина в 200 мл воды [4]), профильтровать. Некоторые авторы советуют добавить в раствор кристаллик тимола для предотвращения роста плесени [5]. Мы не добавляем тимол и не используем методы подкисления эозина, иногда рекомендуемые для повышения интенсивности окраски [5] поскольку обычно в этом нет необходимости, а подкисление может привести к выпадению осадка [4]. Перед использованием профильтровать.

Окрашивание.

Депарафинирование срезов и доведение их до воды. Осуществляется погружением стёкол последовательно в 3 порции ксилола, 3 порции 96° спирта, и 1 порцию 70° спирта - на 3 мин в каждую. При низкой температуре в помещении (менее 22°С) или большой толщине срезов (более 10 мкм) пребывание стёкол в каждой порции ксилола рекомендуется увеличить до 4-5 мин.

Окрашивание в растворе гематоксилина – 1-45 мин [4], точное время окрашивания подбирается предварительно на пробных срезах, поскольку может существенно отличаться для срезов, полученных с разных образцов и свойств раствора красителя; также оно зависит от того, используется прогрессивное или регрессивное окрашивание (см. ниже). Поскольку раствор гематоксилина достаточно густой, медленно стекает и большое его количество будет оставаться на стекле при погружении стекла в краску целиком, для сбережения раствора красителя можно окрашивать срезы, нанося раствор пипеткой на горизонтально расположенные стёкла.

Окрашивание гематоксилином Эрлиха, как и другими квасцовыми гематоксилинами, может быть прогрессивным и регрессивным.

При регрессивном окрашивании срезы сильно перекрашивают, после чего дифференцируют в солянокислом спирте (0.01-1% концентрированной соляной кислоты на 100 мл 70° спирта). Несколько секунд пребывания срезов в этом растворе удаляют большую часть фонового окрашивания и часть окрашивания ядер, точное время зависит от желаемого конечного результата [10] и подбирается на пробных срезах. После этого переходят к следующему этапу дифференцировки (пункту 3 данной методики).

Прогрессивное окрашивание состоит в том, что срезы окрашиваются в течение точно подобранного времени, при котором достигается необходимая окраска ядер, а окружающие ткани остаются практически неокрашенными. Тогда для дифференцировки сразу после окрашивания переходят к пункту 3, минуя солянокислый спирт. Время окрашивания в гематоксилине, как и время дифференцировки, зависит от зрелости раствора гематоксилина, особенностей образца и личных предпочтений исследователя [5]. Коржевский рекомендует 1-5 мин при прогрессивном окрашивании и 20-45 – при регрессивном [4].

Дифференцировка срезов в холодной водопроводной воде (температура воды не должна превышать комнатную) – продолжительность по времени такая же, как и время окрашивания в растворе гематоксилина.

Окрашивание в растворе эозина 0,5-5 мин в зависимости от особенностей образца и свойств красителя (время отрабатывается на пробных срезах).

Ополаскивание в дистиллированной воде. Эозин в ней хорошо вымывается, поэтому обычно бывает достаточно быстро окунуть стекло в воду один раз, не оставляя его там надолго. При сильном перекрашивании эозином стёкла со срезами помещают на 1-5 мин в водопроводную воду [4]. Если эозин слишком быстро вымывается, ополаскивание в дистилляте можно пропустить, и после п.4 перейти сразу к п.6.

Дегидратирование и просветление срезов. Достигается погружением стёкол со срезами в спирты возрастающей концентрации, а затем в ксилолы. Обычно мы используем 1 порцию 70° спирта, 2 порции 96° спирта (вместо второй можно поместить 1 порцию абсолютного спирта), 1 порцию смеси абсолютного или 96° спирта с ксилолом в соотношении 1:1 и 3 порции ксилола. Время пребывания стёкол в спиртах зависит от толщины срезов и быстроты вымывания эозина: от одного-нескольких окунаний до 2-3 мин. В каждой порции ксилола – по 2-3 мин. Если эозин слишком быстро вымывается, 70° спирт можно пропустить.

Заключение в канадский бальзам или его аналоги, такие как Shandon Synthetic Mountant на основе толуола (Thermo Electron Corporation, UK). Преимущество последнего состоит в том, что он прозрачен (в отличие от желтоватого канадского бальзама) и в нём дольше сохраняется окрашивание.

Вместо послесловия, или что представляет собой хорошее окрашивание гематоксилин-эозином?

«Что делает окрашивание ядерным гематоксилином хорошим? На этот вопрос можно дать только очень субъективный ответ. Дело в том, что не существует объективных критериев для определения того, как должно выглядеть «хорошее» ядерное окрашивание. Ядра должны быть чёткими и определёнными, но глубина окрашивания, уровень фонового цитоплазматического окрашивания или окрашивания муцина и т. д. могут сильно различаться и все же оставаться тем, что предпочитает видеть патологоанатом. Возможно, правильный ответ - «хороший» H & E — это то, что предпочитает видеть человек, ставящий диагноз». Llewellyn, B. (2009). Nuclear staining with alum hematoxylin. [10]

Литература:

1. Wayback Machine Internet Archive, http://www.sigmaaldrich.com/img/assets/7361/Primer-H&Emay04.pdf

2. CONN’S Biological Stains: A Handbook of Dyes, Stains and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine, 10^th Ed. Ed. by R.W.Horobin and J.A.Kiernan. Oxford, 2002, P.362.

3. Большая Медицинская Энциклопедия / под ред. Б.В. Петровского, Т.5, издание 3, ‑ М.: «Советская Энциклопедия», 1977. ‑ С.122-3.

4. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии: руководство / под ред. Д.Э. Коржевского. – СПб.: СпецЛит, 2013. – С.48-50, 55-56.

5. Theory and Practice of Histological Techniques, Ed. by J.D. Bancroft and M. Gamble, 5^th Ed., Edinburgh, 2002, P. 126, 761.

6. Bergman R.A., Afifi A.K., Heidger P.M. Atlas of Microscopic Anatomy. A Functional Approach: Companion to Histology and Neuroanatomy (2^nd Ed.). Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1989, P.502.

7. Ромейс Б. Микроскопическая техника / под ред. И.И. Соколова. – М.: Изд-во Иностстранной Литературы, 1954. – С.160.

8. Википедия. Окраска гематоксилином и эозином. https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9E%D0%BA%D1%80%D0%B0%D1%81%D0%BA%D0%B0_%D0%B3%D0%B5%D0%BC%D0%B0%D1%82%D0%BE%D0%BA%D1%81%D0%B8%D0%BB%D0%B8%D0%BD%D0%BE%D0%BC_%D0%B8_%D1%8D%D0%BE%D0%B7%D0%B8%D0%BD%D0%BE%D0%BC

9. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / под ред. В.В. Португалова. – М.: МИР, 1969. – С.163-167.

10. Llewellyn, B. (2009). Nuclear staining with alum hematoxylin. Biotechnic & Histochemistry, 84(4), 159–177. doi:10.1080/10520290903052899

Larson, K., Ho, H.H., Anumolu, P.L., Chen, M.T. (2011). Hematoxylin and Eosin Tissue Stain in Mohs Micrographic Surgery: A Review. Dermatologic Surgery, 37(8), 1089–1099. doi:10.1111/j.1524-4725.2011.02051.x

Bobotsis, R., & Guenther, L. (2016). How Mohs Surgery Transformed Into a First-Line Treatment of Skin Cancer. Journal of Cutaneous Medicine and Surgery, 21(1), 40–41. doi:10.1177/1203475416658289