Гематоксилин и эозин
Обзорное окрашивание гематоксилином и эозином (ОГЭ).
ОГЭ является является традиционным, главным и наиболее широко используемым в научной работе и медицинской диагностике способом обзорного окрашивания гистологических и цитологических препаратов. За редкими исключениями, каждый исследуемый образец сначала подвергается ОГЭ, позволяющему визуализировать ядра и цитоплазму клеток, а также оценить их функциональное состояние [1]. Метод предполагает использование двух красителей: основного (гематоксилина) и кислого (эозина).
Гематоксилин относится к флавоноидам и имеет растительное происхождение. Его получают из эфирного экстракта кампешевого или кровавого дерева (Haematoxylon campechianum, от греч. haima – кровь и hylon – древесина). Сам по себе гематоксилин не обладает красящими способностями, приобретая их после окисления в гематеин, соединения которого с ионами металлов (алюминия, железа, меди, хрома, молибдена, ванадия) дают окрашенные вещества (гематоксилиновые лаки). Поскольку их приготовление начинается с гематоксилина, по традиции именно этот термин используется для названия красителя [2]. Окисление гематоксилина в гематеин (созревание раствора гематоксилина) происходит в течение 2—4 нед. Процесс можно ускорить, добавляя в раствор сильные окислители (йодноватокислый калий или натрий, перманганат калия, перекись водорода и т. п.) [3]. В зависимости от состава и способа приготовления красителя, существуют различные виды гематоксилина, которые можно разделить на несколько групп, в зависимости от того, какой металл используется в качестве протравы, взаимодействующей с гематеином (от неё зависит цвет окраски) [4]. Для ОГЭ применяют квасцовые (алюминиевые) гематоксилины, предусматривающие естественное созревание красителя. Из них нами был выбран гематоксилин Эрлиха, поскольку его отличают быстрота работы, высокая интенсивность окрашивания и большая продолжительность хранения раствора (до нескольких лет) [4, 5]. Интенсивное и чёткое окрашивание ядер гематоксилином Эрлиха выцветает значительно медленнее, чем полученное с помощью других квасцовых гематоксилинов [5].
Все квасцовые гематоксилины исходно окрашивают базофильные структуры (ядерный гетерохроматин, рибосомы и богатые рибонуклеопротеинами (РНП) участки цитоплазмы) в красный цвет, который превращается в знакомый фиолетово- или чёрно-синий при промывании срезов в слабом щелочном растворе. Обычная водопроводная вода, как правило, является достаточно щелочной, для того, чтобы осуществить это превращение, однако иногда необходимы щелочные растворы, такие как насыщенный раствор карбоната лития, 0.05% раствор аммиака в дистиллированной воде или так называемый заменитель водопроводной воды Скотта (Scott’s Tap Water: 2 г K2CO3 и 20 г MgSO4 на 1 л дистиллированной воды) [5]. Процедура эта известна как дифференцировка или ‘bluing’.
Помимо клеточных ядер, гематоксилин Эрлиха прекрасно окрашивает муцины, включая мукополисахариды хряща, поэтому может быть рекомендован для окрашивания хрящевых и костных структур [5]. Он особенно полезен для окрашивания тканей, подвергавшихся воздействию кислоты (например, при декальцинации). Это актуально также для образцов, которые длительное время хранились в формалине, постепенно закисляющемся с течением времени, либо в кислых фиксаторах, таких, как раствор Буэна. Некоторые исследователи не рекомендуют использовать гематоксилин Эрлиха для криостатных срезов [4, 5]. Однако, по более современным данным Ларсон и соавторов [11], ОГЭ является самым широко используемым способом окрашивания в микрографической хирургии Мооса (Mohs micrographic surgery, MMS), которая считается золотым стандартом помощи при немеланомных раках кожи с локализацией на лице и шее [11, 12]. MMS позволяет эффективно удалять злокачественные клетки, успевшие выйти за пределы основной опухоли, максимально сокращая объем резецируемой ткани. Вероятность рецидива при этом падает, а эффективность и эстетический итог операции заметно улучшаются. В MMS операция обычно бывает непредсказуемой по времени и многоэтапной, причём после каждого этапа выполняется срочное гистологическое исследование с помощью ОГЭ на замороженных срезах, от качества которого зависят локализация и масштаб следующих резекций, результат операции в целом, и в конечном счёте, жизнь пациента. Эти данные позволяют заключить, что даже если использование криостатных срезов и ухудшает качество ОГЭ, то для постановки диагноза такое ухудшение не критично.
Несмотря на то, что Г может окрашивать базофильные структуры цитоплазмы, по большей части окрашивание цитоплазмы, а также матрикса соединительной ткани, при ОГЭ осуществляется кислым красителем эозином.
Эозин (от имени Эос – древнегреческой богини утренней зари) – общее название группы органических красителей, относящихся к флюоран-ксантоловым (триарилметановым) соединениям. Комбинация эозина с гематоксилином является оптимальной для демонстрации общей гистологической архитектуры тканей. Особая ценность эозина состоит в том, что при надлежащей дифференцировке он позволяет различать цитоплазму различных типов клеток, а также типы соединительнотканных волокон и внеклеточного матрикса, окрашивая их в различные оттенки [5] (см. ниже). Существуют варианты эозина, марки которых обозначают как Y, G и В, отличающиеся по химическому строению и растворимости в воде и спирте [3]. Мы используем сертифицированный для микроскопии эозин Y в форме натриевой соли (С20H6Br4Na2O5), которая хорошо растворяется как в воде, так и в этаноле [4], несмотря на то, что этот эозин иногда называют водорастворимым [5]. Для рутинной работы мы обычно выбираем 0.1% водный раствор эозина [7], тогда как для срезов со слабой эозинофильностью могут быть использованы 0.5-1% водный [5] или 0.5% водно-спиртовой раствор эозина [4]. В зависимости от прочности связи красителя с разными компонентами ткани, а также времени окрашивания и дифференцировки (см. ниже раздел “Окрашивание”) цитоплазма, клеточные гранулы и соединительнотканные структуры могут окрашиваться в различные оттенки: от ярко-красного до золотисто-жёлтого. При использовании ОГЭ цитоплазма клеток с минимальным содержанием РНП будет лавандового цвета, тогда как зрелые эритроциты млекопитающих, в которых отсутствуют РНП, и сократимые белки мышц окрашиваются эозином в яркий красно-розовый или оранжевый цвет. Области применения эозина очень разнообразны: от селективного окрашивания минерализованной кости до диагностической оценки жизнеспособности сперматозоидов и визуализации изолированных клеток пищеварительной железы мидии [2].
= = = = = = = = = = = = =
ОГЭ – быстрый, простой и удобный способ гистологического окрашивания, который даёт хороший цветовой контраст и легко воспроизводится [9], однако его недостатком является невозможность различать цитоплазматические органеллы и многие другие тканевые компоненты. ОГЭ хорошо выявляет основные морфологические структуры клеток и тканей, но не является специфическим для каких-либо определенных химических соединений, поэтому идентификация окрашенных структур не всегда может быть достоверной [3]. Кроме того, гидрофобные структуры, такие как адипоциты, миелиновая оболочка аксонов и мембрана аппарата Гольджи, плохо окрашиваются ГЭ и требуют применения других методов [8], таких, как окрашивание по Нисслю (см. ниже).
Приготовление растворов красителей.
Гематоксилин Эрлиха:
Гематоксилин – 2 г.
Абсолютный [4, 5] или 96° [4, 8] спирт – 100 мл.
Глицерин – 100 мл.
Дистиллированная вода – 100 мл.
Ледяная уксусная кислота – 10 мл.
Алюмокалиевые квасцы – 3-15 г. ([8] – 3г, [4] – 10-12 г, [5] – около 15 г.)
Гематоксилин растворяют в спирте, после чего добавляют другие реактивы [5]. Коржевский [4] рекомендует отдельно растворить 10-12 г. калийных квасцов в 100 мл. воды при нагревании до 50-60°C, смешать этот раствор со спиртовым раствором гематоксилина, после чего добавить глицерин и ледяную уксусную кислоту [4]. Глицерин добавляется для замедления окислительных процессов и повышения стабильности раствора [5, 9], спирт препятствует росту плесени [9]. Рекомендуется естественное созревание при комнатной температуре, доступе воздуха и солнечного света в течение 14 дней [7] – 2 месяцев [4, 5]. Созревание раствора можно ускорить добавлением йодата натрия в количестве 50 мг на каждый грамм гематоксилина [4]. Коржевский советует добавлять йодат натрия (100 мг для нашей прописи) перед добавлением глицерина (после смешивания спиртового раствора гематоксилина и водного раствора квасцов), разведя его предварительно в 3-5 мл воды, нагретой до 30-40°С. В этом случае окрашивание можно производить в день приготовления раствора, однако продолжительность его хранения сильно уменьшается [4, 5], поэтому мы этот приём не используем. Перед окрашиванием профильтровать.
Эозин:
Растворить необходимое количество (мы используем 0.1 г) эозина в 100 мл дистиллированной воды комнатной температуры (по Коржевскому – 1 г эозина в 200 мл воды [4]), профильтровать. Некоторые авторы советуют добавить в раствор кристаллик тимола для предотвращения роста плесени [5]. Мы не добавляем тимол и не используем методы подкисления эозина, иногда рекомендуемые для повышения интенсивности окраски [5] поскольку обычно в этом нет необходимости, а подкисление может привести к выпадению осадка [4]. Перед использованием профильтровать.
Окрашивание.
Депарафинирование срезов и доведение их до воды. Осуществляется погружением стёкол последовательно в 3 порции ксилола, 3 порции 96° спирта, и 1 порцию 70° спирта - на 3 мин в каждую. При низкой температуре в помещении (менее 22°С) или большой толщине срезов (более 10 мкм) пребывание стёкол в каждой порции ксилола рекомендуется увеличить до 4-5 мин.
Окрашивание в растворе гематоксилина – 1-45 мин [4], точное время окрашивания подбирается предварительно на пробных срезах, поскольку может существенно отличаться для срезов, полученных с разных образцов и свойств раствора красителя; также оно зависит от того, используется прогрессивное или регрессивное окрашивание (см. ниже). Поскольку раствор гематоксилина достаточно густой, медленно стекает и большое его количество будет оставаться на стекле при погружении стекла в краску целиком, для сбережения раствора красителя можно окрашивать срезы, нанося раствор пипеткой на горизонтально расположенные стёкла.
Окрашивание гематоксилином Эрлиха, как и другими квасцовыми гематоксилинами, может быть прогрессивным и регрессивным.
При регрессивном окрашивании срезы сильно перекрашивают, после чего дифференцируют в солянокислом спирте (0.01-1% концентрированной соляной кислоты на 100 мл 70° спирта). Несколько секунд пребывания срезов в этом растворе удаляют большую часть фонового окрашивания и часть окрашивания ядер, точное время зависит от желаемого конечного результата [10] и подбирается на пробных срезах. После этого переходят к следующему этапу дифференцировки (пункту 3 данной методики).
Прогрессивное окрашивание состоит в том, что срезы окрашиваются в течение точно подобранного времени, при котором достигается необходимая окраска ядер, а окружающие ткани остаются практически неокрашенными. Тогда для дифференцировки сразу после окрашивания переходят к пункту 3, минуя солянокислый спирт. Время окрашивания в гематоксилине, как и время дифференцировки, зависит от зрелости раствора гематоксилина, особенностей образца и личных предпочтений исследователя [5]. Коржевский рекомендует 1-5 мин при прогрессивном окрашивании и 20-45 – при регрессивном [4].
Дифференцировка срезов в холодной водопроводной воде (температура воды не должна превышать комнатную) – продолжительность по времени такая же, как и время окрашивания в растворе гематоксилина.
Окрашивание в растворе эозина 0,5-5 мин в зависимости от особенностей образца и свойств красителя (время отрабатывается на пробных срезах).
Ополаскивание в дистиллированной воде. Эозин в ней хорошо вымывается, поэтому обычно бывает достаточно быстро окунуть стекло в воду один раз, не оставляя его там надолго. При сильном перекрашивании эозином стёкла со срезами помещают на 1-5 мин в водопроводную воду [4]. Если эозин слишком быстро вымывается, ополаскивание в дистилляте можно пропустить, и после п.4 перейти сразу к п.6.
Дегидратирование и просветление срезов. Достигается погружением стёкол со срезами в спирты возрастающей концентрации, а затем в ксилолы. Обычно мы используем 1 порцию 70° спирта, 2 порции 96° спирта (вместо второй можно поместить 1 порцию абсолютного спирта), 1 порцию смеси абсолютного или 96° спирта с ксилолом в соотношении 1:1 и 3 порции ксилола. Время пребывания стёкол в спиртах зависит от толщины срезов и быстроты вымывания эозина: от одного-нескольких окунаний до 2-3 мин. В каждой порции ксилола – по 2-3 мин. Если эозин слишком быстро вымывается, 70° спирт можно пропустить.
Заключение в канадский бальзам или его аналоги, такие как Shandon Synthetic Mountant на основе толуола (Thermo Electron Corporation, UK). Преимущество последнего состоит в том, что он прозрачен (в отличие от желтоватого канадского бальзама) и в нём дольше сохраняется окрашивание.
Вместо послесловия, или что представляет собой хорошее окрашивание гематоксилин-эозином?
«Что делает окрашивание ядерным гематоксилином хорошим? На этот вопрос можно дать только очень субъективный ответ. Дело в том, что не существует объективных критериев для определения того, как должно выглядеть «хорошее» ядерное окрашивание. Ядра должны быть чёткими и определёнными, но глубина окрашивания, уровень фонового цитоплазматического окрашивания или окрашивания муцина и т. д. могут сильно различаться и все же оставаться тем, что предпочитает видеть патологоанатом. Возможно, правильный ответ - «хороший» H & E — это то, что предпочитает видеть человек, ставящий диагноз». Llewellyn, B. (2009). Nuclear staining with alum hematoxylin. [10]
Литература:
1. Wayback Machine Internet Archive, http://www.sigmaaldrich.com/img/assets/7361/Primer-H&Emay04.pdf
2. CONN’S Biological Stains: A Handbook of Dyes, Stains and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine, 10th Ed. Ed. by R.W.Horobin and J.A.Kiernan. Oxford, 2002, P.362.
3. Большая Медицинская Энциклопедия / под ред. Б.В. Петровского, Т.5, издание 3, ‑ М.: «Советская Энциклопедия», 1977. ‑ С.122-3.
4. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии: руководство / под ред. Д.Э. Коржевского. – СПб.: СпецЛит, 2013. – С.48-50, 55-56.
5. Theory and Practice of Histological Techniques, Ed. by J.D. Bancroft and M. Gamble, 5th Ed., Edinburgh, 2002, P. 126, 761.
6. Bergman R.A., Afifi A.K., Heidger P.M. Atlas of Microscopic Anatomy. A Functional Approach: Companion to Histology and Neuroanatomy (2nd Ed.). Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1989, P.502.
7. Ромейс Б. Микроскопическая техника / под ред. И.И. Соколова. – М.: Изд-во Иностстранной Литературы, 1954. – С.160.
8. Википедия. Окраска гематоксилином и эозином. https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9E%D0%BA%D1%80%D0%B0%D1%81%D0%BA%D0%B0_%D0%B3%D0%B5%D0%BC%D0%B0%D1%82%D0%BE%D0%BA%D1%81%D0%B8%D0%BB%D0%B8%D0%BD%D0%BE%D0%BC_%D0%B8_%D1%8D%D0%BE%D0%B7%D0%B8%D0%BD%D0%BE%D0%BC
9. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / под ред. В.В. Португалова. – М.: МИР, 1969. – С.163-167.
10. Llewellyn, B. (2009). Nuclear staining with alum hematoxylin. Biotechnic & Histochemistry, 84(4), 159–177. doi:10.1080/10520290903052899
Larson, K., Ho, H.H., Anumolu, P.L., Chen, M.T. (2011). Hematoxylin and Eosin Tissue Stain in Mohs Micrographic Surgery: A Review. Dermatologic Surgery, 37(8), 1089–1099. doi:10.1111/j.1524-4725.2011.02051.x
Bobotsis, R., & Guenther, L. (2016). How Mohs Surgery Transformed Into a First-Line Treatment of Skin Cancer. Journal of Cutaneous Medicine and Surgery, 21(1), 40–41. doi:10.1177/1203475416658289