Создание систематизированных тематических баз данных является эффективным решением для оцифровывания, упорядочивания и объединения существующих и постоянно пополняющихся данных в разных областях биологии и медицины. Сбор данных о развитии головного мозга, в том числе данных об иммунофенотипе различных областей мозга, является важной задачей (Для обзора см. "Современные тенденции картирования головного мозга").
Целью проекта АТЛАС РАЗВИТИЯ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА (АРМЧ) является создание иммунофенотипической карты нейрогенеза во время нормального внутриутробного развития в отдельных областях коры головного мозга человека с учетом внутри- и межрегиональной специфики созревания и гетерохроний развития.
Материал
Основным материалом для проекта служит обновляемая #Коллекция пренатального развития человека лаборатории развития нервной системы НИИ Морфологии человека, которая охватывает период со 2-й недели внутриутробного развития до рождения. Работа с материалом ведется в рамках международных соглашений и одобрена локальным этическим комитетом ФГБНУ НИИ морфологии человека.
Эмбриональный и плодный материал по раннему развитию человека - очень индивидуально изменчив. Периодизация развития эмбрионов носит весьма условный характер, так как в реальном онтогенезе не существует никаких "стадий". Тем не менее для удобства определения возраста и описания эмбрионов и плодов мы используем классификацию, предложенную в 2006 г. Миловановым и Савельевым.
В этой классификации выделяются:
- Зародышевый период от 1до 21 дня после оплодотворения, включающий 1-8 стадии развития по Карнеги
- Эмбриональный период с 22 по 56-57 день после оплодотворения, 9-23 стадии по Карнеги.
- Предплодный период (9-10 недели после оплодотворения (по), 11-12 - акушерский (гестационный) возраст (гв), постменструальный срок).
- Плодный период с 13 недель гв до рождения ребенка.
В свою очередь плодный период можно подразделить на три отрезка:
- Раннефетальный период - 13-20 нед. гв
- Среднефетальный период - 21-28 нед. гв
- Позднефетальный период - 29-40 нед. гв
Гистологические методы.
Большая часть коллекции хранится в забуференном формалине. Для гистологического исследования изготавливаются серийные срезы полушария, или мозга, или головы плода целиком в зависимости от стадии развития плода. Полученные срезы окрашиваются в соответствии с применяемой методикой гематоксилином и эозином, по Маллори или по Нисслю.
Иммуногистохимические методы (ИГХ)
В наших исследованиях мы традиционно применяем сравнительный иммуноморфологический подход: на разных стадиях развития изготавливаются кассированные серии срезов аутопсийного материала интересующего органа. На последовательных сериях срезов проводится референсное гистологическое окрашивание и ставятся реакции с антителами к различным популяциям клеток, что позволяет сопоставлять иммунофенотипы на соседних срезах и отслеживать пространственно-временную динамику в зонах интереса по мере роста и развития органа, используя морфометрические исследования с их последующей статистической обработкой. Мы применяем этот же подход на целых срезах головного мозга человека во время пренатального развития. Преимуществом иммуноморфологичсекого подхода является совмещение классического цитоархитектонического анализа с современными иммуногистохимическими техниками, что позволит провести анализ иммунофенотипа конкретных участков коры развивающегося мозга и осуществить регионспецифичное типирование клеток различных линий дифференцировки на разных этапах пренатального онтогенеза с последующим сравнением разных регионов. Немаловажно, что, благодаря современным методам иммуногистохимии и иммунофлуоресценции, на одном срезе можно отслеживать сразу несколько маркеров.
Выбор линейки маркеров для реализации проекта иммуноморфологического анализа обусловлен как собственным опытом и данными о стабильности работы антител на материале плодов человека, так и опубликованными данными оригинальных исследований и общедоступной информацией в рамках тематических международных проектов. Предпочтение в каждой очереди опытов отдается маркерам, наиболее хорошо зарекомендовавшим себя в мировой научно-исследовательской и медицинской практике и стабильно работающим на материале плодов человека. Таким образом, результаты будут сопоставимы для сравнения с результатами других научных групп, полученными на материале эмбрионов и плодов человека.
Оцифровка срезов мозга
Для базовых аннотированных атласов создаются библиотеки изображений виртуальных срезов с детализацией, доступной для объективов светового микроскопа (до сорокакратного увеличения). Оцифровка препаратов проводится с помощью системы создания виртуальных слайдов гистологических препаратов на установке МЕКОС-Ц2. Система собирает сотни отдельных полей зрения в продольные полосы, которые позже сшиваются вместе, чтобы создать одно большое изображение. Время экспозиции, баланс белого и коррекция плоского поля устанавливаются независимо для каждого среза. Постобработка, полученных изображений, включает в себя перевод из внутреннего формата системы в файлы формата svs, а затем для выбранных срезов переводится в формат Jpg, для создание основы для референсного атласа и для предоставления на сайте проекта. Параллельно проводится финальная корректировка полученных изображений.
Разметка и аннотирование структур головного мозга плодов
Отдельной задачей является картирование и аннотирование виртуальных препаратов . Цифровые изображения гистологических срезов размечаются и подписываются в программе Adobe illustrator. Каждая векторная область связана с определенной структурой мозга и аннотирована; сопоставляющий вектор таким образом позволяет гибко создавать различные режимы представления (например, осуществлять заливку).Полученная векторная графика преобразовывается в масштабируемую векторную графику (SVG).
Аннотирование производится в соответствии с принятой в 2019 г. международной эмбриологической терминологией (TE2) и публикациями по развитию определенных структур со специальными ссылками на принципы эволюционной номенклатуры. Различия между существующими неврологическими традициями сопоставляются с классическими немецкими, американскими и российскими (Советский Союз) онтологическими принципами и с недавним "стандартом" анатомической онтологии, представленным в Nieuwenhuys et al. (2008), Terminologia Neuroanatomica (Ten Donkelaar et al., 2017) и Атласе мозга Аллена в качестве онлайн-источника (https://atlas.brain-map.org /). Структуры картируются и аннотируются в соответствии со сравнительными эволюционными и онтогенетическими критериями – от общего к частному, от сложных структур к частям и подразделениям в соответствии с ходом развития. Предварительная разметка производится в соответствии с Атласом мозга Аллена в качестве онлайн-источника (https://atlas.brain-map.org /)
Литература:
- Внутриутробное развитие человека/ Руководство для врачей / Под редакцией А.П. Милованова, С.В. Савельева. — М.: МВД, 2006. — 384 с.
Больше информации о современных тенденциях картирования мозга